利用高能量聚焦超聲誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的新策略研究.pdf

1、研究背景：高強(qiáng)度聚焦超聲（high-intensity focused ultrasound，HIFU）作為腫瘤治療的新技術(shù)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。其工作原理是利用超聲波穿透性、方向性、聚焦性好的特點(diǎn)，將體外低能量的超聲聚焦于體內(nèi)腫瘤組織，在焦點(diǎn)區(qū)域高能量的超聲，通過(guò)高熱效應(yīng)較精確地殺死腫瘤細(xì)胞，而不損傷周?chē)M織。由于一般HIFU的焦域較小，約為10×3×3 mm，因此整個(gè)腫瘤的治療需要逐點(diǎn)和逐層的焦點(diǎn)掃描或分多次治療來(lái)完成。當(dāng)前，臨床上

2、HIFU治療腫瘤普遍采用密集掃描的策略，其目的是為了產(chǎn)生密集排列的熱變性區(qū)域（thermal lesions），以保證盡可能徹底地殺滅腫瘤細(xì)胞，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。但是臨床實(shí)踐表明，盡管采用這種密集掃描的治療策略，仍不能完全殺滅腫瘤細(xì)胞，HIFU治療后的原位復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率都相當(dāng)高。我們的前期研究表明，HIFU能通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞誘塵和局部釋放多種內(nèi)源性樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）激活因子，刺激DC活化和成熟，進(jìn)而誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)

3、HIFU治療后可以招募DC細(xì)胞向瘤內(nèi)的熱損傷部位聚集，而且DC主要聚集于熱變性區(qū)域的周?chē)鷧^(qū)域。根據(jù)HIFU治療時(shí)瘤內(nèi)溫度變化的分布曲線，該區(qū)域溫度在HIFU處理的4秒內(nèi)上升至55℃左右，低于焦域內(nèi)的80℃。這提示受到不同程度HIFU熱效應(yīng)損傷的腫瘤細(xì)胞可能具有不同的刺激DC活化成熟和誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。基于這些研究結(jié)果，我們進(jìn)一步推測(cè)，如果把現(xiàn)行的密集掃描策略改為采用稀疏的掃描策略，造成離散的熱損傷灶，能保留對(duì)DCs成熟刺激能力更強(qiáng)的

4、熱損傷灶周?chē)鷧^(qū)域的腫瘤細(xì)胞，最終增強(qiáng)HIFU誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　 研究目的：旨在通過(guò)優(yōu)化HIFU的治療參數(shù)和掃描策略來(lái)更有效的刺激DC成熟，從而增強(qiáng)HIFU誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用，為進(jìn)一步挖掘HIFU免疫調(diào)控的潛力指明方向。
　　 研究方法：采用上海愛(ài)申科技發(fā)展公司提供的高能量聚焦超聲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣機(jī)建立HIFU實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。建立兩套不同的HIFU腫瘤治療策略，其中一套采用密集掃描策略，以模擬傳統(tǒng)HIFU治療效應(yīng)：另一

5、套采用稀疏掃描策略，以保存每個(gè)熱變性區(qū)域的周?chē)M織。采用B16黑色素瘤和MC-38結(jié)腸腺癌C57BL∕c小鼠模型。實(shí)驗(yàn)中將腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右后肢皮下，待腫瘤直徑長(zhǎng)至8-10mm大小后進(jìn)行HIFU治療。荷瘤小鼠分別使用密集掃描或稀疏掃描策略進(jìn)行HIFU治療后，切除腫瘤，用免疫組織化學(xué)方法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIFU治療部位的DC浸潤(rùn)情況。為比較受到不同程度HIFU熱效應(yīng)損傷的腫瘤細(xì)胞是否具有不同的刺激DC成熟的能力，經(jīng)不同HIFU處理的腫瘤

6、細(xì)胞分別與未成熟的DC共孵育，檢測(cè)共孵育細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-12和IL-10的分泌量以及DC細(xì)胞表面CD80/CD86的表達(dá)水平。通過(guò)分析不同的HIFU治療過(guò)的荷瘤小鼠脾臟的IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)以及對(duì)再次攻擊腫瘤的生長(zhǎng)阻滯作用，評(píng)估HIFU誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　 結(jié)果：成功搭建荷瘤小鼠體內(nèi)HIFU治療和腫瘤細(xì)胞體外HIFU處理的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。以MC-38小鼠結(jié)腸癌和B16黑色素瘤荷瘤小鼠為動(dòng)物模型，對(duì)HIFU系統(tǒng)進(jìn)行了治療參

7、數(shù)的校準(zhǔn)，使其可以在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生與臨床一致的熱效應(yīng)，單點(diǎn)HIFU治療造成典型的熱變性區(qū)域。分析了HIFU治療后瘤內(nèi)DC聚集的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)HIFU治療可以招引DC細(xì)胞向瘤內(nèi)的熱損傷部位聚集，而且DC主要聚集于熱變性區(qū)域的周?chē)鷧^(qū)域，該區(qū)域溫度在HIFU處理的4s內(nèi)上升至55℃左右，低于焦域內(nèi)的80℃。采用腫瘤細(xì)胞-DC共培養(yǎng)系統(tǒng)證明：HIFU處理的腫瘤細(xì)胞具有顯著的刺激DC成熟的作用，而且55℃-HIFU處理的腫瘤細(xì)胞的DC刺激活性明顯高于

8、80℃-HIFU處理的腫瘤細(xì)胞。提供證據(jù)表明不同HIFU處理的腫瘤細(xì)胞刺激DC細(xì)胞成熟的作用機(jī)制與其誘導(dǎo)HMGB1釋放和HSP70/HSP90向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明稀疏掃描策略HIFU可以產(chǎn)生與密集掃描策略類(lèi)似的對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果，但其誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤應(yīng)答遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于密集掃描策略HIFU。腫瘤再攻擊實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用稀疏掃描策略的HIFU治療個(gè)體，抵御腫瘤再攻擊的能力增強(qiáng)。進(jìn)一步分析瘤內(nèi)DC細(xì)胞的數(shù)目及其成熟狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)稀疏掃描策