利用高能量聚焦超聲誘導抗腫瘤免疫的新策略研究.pdf

1、研究背景：高強度聚焦超聲（high-intensity focused ultrasound，HIFU）作為腫瘤治療的新技術(shù)引起了越來越多的關(guān)注。其工作原理是利用超聲波穿透性、方向性、聚焦性好的特點，將體外低能量的超聲聚焦于體內(nèi)腫瘤組織，在焦點區(qū)域高能量的超聲，通過高熱效應(yīng)較精確地殺死腫瘤細胞，而不損傷周圍組織。由于一般HIFU的焦域較小，約為10×3×3 mm，因此整個腫瘤的治療需要逐點和逐層的焦點掃描或分多次治療來完成。當前，臨床上

2、HIFU治療腫瘤普遍采用密集掃描的策略，其目的是為了產(chǎn)生密集排列的熱變性區(qū)域（thermal lesions），以保證盡可能徹底地殺滅腫瘤細胞，預(yù)防腫瘤復發(fā)。但是臨床實踐表明，盡管采用這種密集掃描的治療策略，仍不能完全殺滅腫瘤細胞，HIFU治療后的原位復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率都相當高。我們的前期研究表明，HIFU能通過損傷腫瘤細胞誘塵和局部釋放多種內(nèi)源性樹突狀細胞（DC）激活因子，刺激DC活化和成熟，進而誘導特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。進一步的研究發(fā)現(xiàn)

3、HIFU治療后可以招募DC細胞向瘤內(nèi)的熱損傷部位聚集，而且DC主要聚集于熱變性區(qū)域的周圍區(qū)域。根據(jù)HIFU治療時瘤內(nèi)溫度變化的分布曲線，該區(qū)域溫度在HIFU處理的4秒內(nèi)上升至55℃左右，低于焦域內(nèi)的80℃。這提示受到不同程度HIFU熱效應(yīng)損傷的腫瘤細胞可能具有不同的刺激DC活化成熟和誘導抗腫瘤免疫的能力?；谶@些研究結(jié)果，我們進一步推測，如果把現(xiàn)行的密集掃描策略改為采用稀疏的掃描策略，造成離散的熱損傷灶，能保留對DCs成熟刺激能力更強的

4、熱損傷灶周圍區(qū)域的腫瘤細胞，最終增強HIFU誘導的系統(tǒng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　 研究目的：旨在通過優(yōu)化HIFU的治療參數(shù)和掃描策略來更有效的刺激DC成熟，從而增強HIFU誘導的抗腫瘤免疫作用，為進一步挖掘HIFU免疫調(diào)控的潛力指明方向。
　　 研究方法：采用上海愛申科技發(fā)展公司提供的高能量聚焦超聲動物實驗樣機建立HIFU實驗系統(tǒng)。建立兩套不同的HIFU腫瘤治療策略，其中一套采用密集掃描策略，以模擬傳統(tǒng)HIFU治療效應(yīng)：另一

5、套采用稀疏掃描策略，以保存每個熱變性區(qū)域的周圍組織。采用B16黑色素瘤和MC-38結(jié)腸腺癌C57BL∕c小鼠模型。實驗中將腫瘤細胞接種于小鼠右后肢皮下，待腫瘤直徑長至8-10mm大小后進行HIFU治療。荷瘤小鼠分別使用密集掃描或稀疏掃描策略進行HIFU治療后，切除腫瘤，用免疫組織化學方法和流式細胞術(shù)檢測HIFU治療部位的DC浸潤情況。為比較受到不同程度HIFU熱效應(yīng)損傷的腫瘤細胞是否具有不同的刺激DC成熟的能力，經(jīng)不同HIFU處理的腫瘤

6、細胞分別與未成熟的DC共孵育，檢測共孵育細胞培養(yǎng)基上清中IL-12和IL-10的分泌量以及DC細胞表面CD80/CD86的表達水平。通過分析不同的HIFU治療過的荷瘤小鼠脾臟的IFN-γ分泌細胞數(shù)以及對再次攻擊腫瘤的生長阻滯作用，評估HIFU誘導的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　 結(jié)果：成功搭建荷瘤小鼠體內(nèi)HIFU治療和腫瘤細胞體外HIFU處理的實驗系統(tǒng)。以MC-38小鼠結(jié)腸癌和B16黑色素瘤荷瘤小鼠為動物模型，對HIFU系統(tǒng)進行了治療參

7、數(shù)的校準，使其可以在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生與臨床一致的熱效應(yīng)，單點HIFU治療造成典型的熱變性區(qū)域。分析了HIFU治療后瘤內(nèi)DC聚集的特點，發(fā)現(xiàn)HIFU治療可以招引DC細胞向瘤內(nèi)的熱損傷部位聚集，而且DC主要聚集于熱變性區(qū)域的周圍區(qū)域，該區(qū)域溫度在HIFU處理的4s內(nèi)上升至55℃左右，低于焦域內(nèi)的80℃。采用腫瘤細胞-DC共培養(yǎng)系統(tǒng)證明：HIFU處理的腫瘤細胞具有顯著的刺激DC成熟的作用，而且55℃-HIFU處理的腫瘤細胞的DC刺激活性明顯高于

8、80℃-HIFU處理的腫瘤細胞。提供證據(jù)表明不同HIFU處理的腫瘤細胞刺激DC細胞成熟的作用機制與其誘導HMGB1釋放和HSP70/HSP90向細胞膜轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。體內(nèi)實驗證明稀疏掃描策略HIFU可以產(chǎn)生與密集掃描策略類似的對原發(fā)腫瘤的治療效果，但其誘導的特異性抗腫瘤應(yīng)答遠遠高于密集掃描策略HIFU。腫瘤再攻擊實驗發(fā)現(xiàn)采用稀疏掃描策略的HIFU治療個體，抵御腫瘤再攻擊的能力增強。進一步分析瘤內(nèi)DC細胞的數(shù)目及其成熟狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)稀疏掃描策