GLP-1重組畢赤酵母的構建和rGLP-1的表達、純化及鑒定.pdf

1、目的:構建GLP-1重組畢赤酵母,篩選出高表達rGLP-1的重組畢赤酵母株,優(yōu)化rGLP-1表達條件和建立純化工藝,鑒定純化后的rGLP-1純度和生物活性.方法:通過PCR方法獲得的GLP-1基因片段,經(jīng)Not Ⅰ酶切后,插入到質(zhì)粒pPIC9K中.重組的GLP-1-pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后,通過His-和G418平板篩選高表達菌株.設定四個不同的甲醇濃度,研究其對rGLP-1表達量的影響,同時研究了誘導時間的變化對rGL

2、P-1表達量的影響.應用反相層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析對rGLP-1進行純化.并用SDS-PAGE和HPLC對純化后的rGLP-1純度進行鑒定.使用RINm5F細胞檢測純化后的rGLP-1體外促進胰島素分泌的活性.建立2型糖尿病大鼠模型,并在此模型中對rGLP-1的體內(nèi)降血糖作用進行研究.結果:1、成功構建了重組GLP-1畢赤酵母.2、篩選出高表達rGLP-1的重組GLP-1畢赤酵母株.3、證實在1%的甲醇濃度和誘導三天時,rG

3、LP-1表達量最高.4、優(yōu)化出的純化工藝:離心→反相層析→陰離子交換層析→凝膠過濾→凍干.5、純度鑒定認為rGLP-1 SDS-PAGE未見其他雜帶,HPLC證實純化的rGLP-1純度達到97%.6、純化后的rGLP-1在體外可以明顯促進RINm5F細胞分泌胰島素,7、體內(nèi)實驗證實rGLP-1可以降低糖尿病大鼠血糖至正常水平.結論:獲得了高表達rGLP-1的重組GLP-1畢赤酵母株,優(yōu)化了rGLP-1的表達條件.建立了純化工藝,rGLP