重組雙堿基內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達(dá)制備及酶活鑒定.pdf

1、Kex2即雙堿基內(nèi)肽酶，也稱為Kexin、Paired-basic endopeptidase、Prohormone-processing endoprotease等，這些名稱從不同的角度反應(yīng)了Kex2的酶學(xué)性質(zhì)。Kex2基因來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisia，屬于枯草桿菌蛋白酶家族，是一個(gè)鈣離子依賴型的絲氨酸蛋白水解酶。Kex2能特異性識(shí)別蛋白質(zhì)或多肽中的雙堿性氨基酸殘基對(duì)(Lys-Arg、Arg-Arg）及P

2、ro-Arg，從第二個(gè)氨基酸殘基羧基端（即R-）切斷肽鍵，發(fā)揮作用。Kex2作為前體加工酶的原型，對(duì)其的研究大大促進(jìn)了其他各種真核生物前體加工酶的研究進(jìn)步。另外，人們還發(fā)現(xiàn)Kex2能在體內(nèi)和體外環(huán)境下完成對(duì)于一些激素原前體、蛋白前體的酶切加工。所以，由于其酶切位點(diǎn)的特異性，近幾年Kex2在生物制藥領(lǐng)域逐漸顯示地位。要想深入進(jìn)行上述研究，首先必須得到大量Kex2酶，才能進(jìn)行體內(nèi)和體外各項(xiàng)研究。目前對(duì)于Kex2的結(jié)構(gòu)及酶活性等研究已經(jīng)較為全

3、面，而對(duì)于Kex2的重組構(gòu)建及制備的研究還較少。雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但是能夠篩選到高表達(dá)量的重組工程菌，用于發(fā)酵并完成后續(xù)純化過程得到Kex2純品的研究相對(duì)較少，本文致力于完成這一研究目標(biāo)和內(nèi)容。本項(xiàng)目中創(chuàng)新地設(shè)計(jì)重組雙堿基內(nèi)肽酶Kex2蛋白序列和應(yīng)用于畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的核苷酸序列，構(gòu)建能夠正確表達(dá)Kex2酶的畢赤酵母重組表達(dá)菌從而提高Kex2產(chǎn)量；摸索重組表達(dá)菌上罐發(fā)酵工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)；建立穩(wěn)定、重復(fù)性好、回收率高的純化工

4、藝，以得到 Kex2純品；建立Kex2濃度測(cè)定方法、活性測(cè)定方法，并將其用于蛋白類底物的酶切實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其活性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①重組Kex2 cDNA序列的設(shè)計(jì)參閱文獻(xiàn)，選擇Kex2蛋白序列2-660殘基，并在N端設(shè)計(jì)His標(biāo)簽LEKRSARGSHHHHHH以利于下游純化，；并根據(jù)P.Pastoris密碼子使用偏好性，設(shè)計(jì)了Kex2的cDNA，設(shè)計(jì)終止密碼子TGA和TAA，設(shè)計(jì)上下游酶切位點(diǎn)XhoI（CTCGAG）和N

5、otI（GCGGCCGC）限制性酶切位點(diǎn)。②重組表達(dá)菌pPICZαA-Kex2/X-33的構(gòu)建全基因合成cDNA序列，得到含有目的序列的甘油菌。抽提質(zhì)粒，XhoI和NotI雙酶切后連入載體pPICZαA，轉(zhuǎn)化Top10F’感受態(tài)細(xì)胞，篩選后得到重組質(zhì)粒pPICZαA-Kex2。用Sac I線性化重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入X-33感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，利用抗性平板等方法篩選高表達(dá)菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定為發(fā)酵用表達(dá)菌。③發(fā)

6、酵工藝建立初期用搖瓶發(fā)酵的方式來篩選重組表達(dá)菌最適溫度、pH、溶氧等條件，隨后上罐發(fā)酵，摸索并建立發(fā)酵工藝，確定發(fā)酵培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)方式等等。④發(fā)酵上清的純化工藝建立根據(jù)設(shè)計(jì)蛋白序列的創(chuàng)新性，優(yōu)選試用Ni離子金屬鰲合柱進(jìn)行初純化。后選擇離子柱進(jìn)行純化，去掉多余的雜質(zhì)。⑤自制Kex2樣品酶切活性鑒定針對(duì)于Kex2酶切特異性選擇特異性測(cè)活底物、短肽、蛋白類三種不同底物，建立各自酶切方法，分別驗(yàn)證自制Kex2酶切活性和特異性。研究表明：

7、成功構(gòu)建了pPICZαA-Kex2/X-33重組表達(dá)菌，完成了Kex2在畢赤酵母系統(tǒng)的重組表達(dá)；對(duì)篩選出的表達(dá)量最高的菌株完成了10L上罐發(fā)酵，并創(chuàng)新地采用Ni離子金屬鰲合柱初純化、脫鹽柱處理后陰離子柱再純化，得到了電泳純度95％以上的重組Kex2樣品；隨后對(duì)樣品進(jìn)行了濃度和純度檢測(cè)，最重要的是對(duì)酶切效率和特異性進(jìn)行了三種底物水平的檢測(cè)，證明自制的Kex2樣品在以特異性底物Boc-QRR-pNA、短肽（含有KR識(shí)別位點(diǎn)）、蛋白質(zhì)水平（甘