重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定.pdf

1、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)是一種對(duì)造血細(xì)胞有重要作用的細(xì)胞因子，主要作用于早期多能干細(xì)胞或原始造血祖細(xì)胞，促進(jìn)這些細(xì)胞的存活、增殖和分化，具有重要的應(yīng)用前景。當(dāng)前，美國(guó)安進(jìn)公司的rhSCF已在臨床上應(yīng)用，同時(shí)多個(gè)臨床應(yīng)用方向的研究也正在進(jìn)行中。國(guó)內(nèi)多家單位的研究已進(jìn)行到臨床階段，但是以上rhSCF的生產(chǎn)都是建立在原核表達(dá)系統(tǒng)上的。為了發(fā)展在真核表達(dá)系統(tǒng)的rhSCF生物制劑，推進(jìn)它的臨床應(yīng)用，本文設(shè)計(jì)了rhSC

2、F的酵母表達(dá)系統(tǒng)、實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)、純化得到高活性的rhSCF，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 為了實(shí)現(xiàn)rhSCF在畢赤酵母中的高效表達(dá)，通過(guò)設(shè)計(jì)酵母菌喜好密碼子的cDNA，并采用PCR技術(shù)對(duì)分別合成的寡核苷酸片段進(jìn)行拼接，合成全長(zhǎng)rhSCF的cDNA。在cDNA轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌前，將目標(biāo)基因克隆入p-GEMT載體并進(jìn)行DNA測(cè)序，構(gòu)建重組pAO815SM1/rhSCF表達(dá)載體，通過(guò)原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并進(jìn)行了G418耐受試驗(yàn)和誘導(dǎo)表達(dá)

3、的大規(guī)模篩選。
　　 為了實(shí)現(xiàn)建立高效的發(fā)酵、純化生產(chǎn)工藝，本文進(jìn)行了工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化和30L發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，目的蛋白通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行捕獲、初步純化，分子排阻色譜柱精細(xì)純化和原液制備。
　　 為了驗(yàn)證和控制產(chǎn)品的質(zhì)量，本文采用HPLC法、質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、N端測(cè)序、紫外掃描和MTT法等技術(shù)對(duì)產(chǎn)品的純度、分子量、等電點(diǎn)、胰酶肽圖、N端序列、紫外光譜特性和細(xì)胞學(xué)生物活性進(jìn)行了鑒定。應(yīng)用HPLC、

4、質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)rhSCF分子的包括氨基酸序列、二硫鍵、糖基化位點(diǎn)和糖鏈進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)解析，判斷產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)信息是否與預(yù)期的一致。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文合成的cDNA序列與目標(biāo)基因完全一致，重組pAO815SM1/rhSCF表達(dá)載體含有目標(biāo)基因；轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌后，通過(guò)G418壓力篩選和誘導(dǎo)表達(dá)篩選獲得高拷貝的高表達(dá)菌株，表達(dá)量約50mg/L;通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，大規(guī)模發(fā)酵的rhSCF表達(dá)水平達(dá)100mg/L;HPLC-SEC法檢測(cè)目

5、標(biāo)蛋白的純度為99.7％，電泳法顯示目標(biāo)蛋白為糖基化和未糖基化的混合體，目標(biāo)蛋白含量大于99%;質(zhì)譜法得到蛋白分子量主帶分布在18-22KD之間，電泳法顯示蛋白的分子量分別約為18KD（未糖基化）和21KD（糖基化）：產(chǎn)品的等電點(diǎn)為5.38和5.26，其中等電點(diǎn)為5.38樣品約占81.7％；建立起了胰酶肽圖的分析方法：N端測(cè)序與理論序列相一致；紫外掃描特性符合蛋白質(zhì)的特性；rhSCF原液比活性為1×106IU/mg;結(jié)構(gòu)解析顯示蛋白的氨