畢赤酵母重組人hepcidin25的高效表達(dá)、純化及部分鐵代謝活性研究.pdf

1、Hepcidin是一種由肝臟表達(dá)的富含半胱氨酸殘基的小分子肽，對于調(diào)節(jié)機(jī)體鐵離子代謝平衡發(fā)揮著重要作用。與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，hepcidin同樣具有廣譜的抗菌作用。本文對構(gòu)建的分泌表達(dá)人hepcidin巴斯德畢赤酵母重組pPICZα A-Hepc菌株的高表達(dá)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了重組人-hepcidin的純化工藝，通過抑菌及小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)酵母表達(dá)重組人-hepcidin25具有抗微生物活性及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝活性

2、。 巴斯德畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有其不足之處，比如產(chǎn)量普遍較低。提高產(chǎn)量，除了可選用強(qiáng)啟動子，使用酵母偏愛的密碼子及外源基因高拷貝整合等方法，在發(fā)酵過程中控制生物反應(yīng)狀態(tài)，使細(xì)胞生長至高的密度并使細(xì)胞生理狀態(tài)維持高的活力，以獲得盡可能多的產(chǎn)品也至關(guān)重要。針對這一問題，本文優(yōu)化巴斯德畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件，考察了不同培養(yǎng)基C源N源對細(xì)胞生長及外源基因表達(dá)的影響。在搖瓶中，對發(fā)酵條件進(jìn)行了研究．發(fā)

3、現(xiàn)較適合的培養(yǎng)條件為：基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖20g/L為碳源，蛋白胨20g/L，0．1mol/L磷酸鉀緩沖，起始pH6．0，250 ml搖瓶裝液量25ml，生物素4×10-4g/L，YNB13．4g/L（同比總體積量分批加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基），甲醇誘導(dǎo)濃度0．5%，發(fā)酵3d后，目的蛋白產(chǎn)量可達(dá)150mg/L。 對重組畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌至胞外存在于發(fā)酵液的hepcidin進(jìn)一步分離純化，選用等電沉淀，硫酸銨分

4、級沉淀，陰離子交換層析，陽離子交換層析，凝膠過濾純化，反相色譜純化等步驟，確定純化工藝為等電沉淀，凝膠分子篩層析，反相色譜精純，得到的目的蛋白電泳檢測樣品呈現(xiàn)單一條帶，純度不低于90%。質(zhì)譜分析重組hepcidn分子量與計(jì)算一致，CD光譜證實(shí)重組hepcidin結(jié)構(gòu)與天然類似。 通過抑菌實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)染小鼠內(nèi)皮細(xì)胞w estern blot檢測胞內(nèi)GFP-FPN1及TfR1的變化測定重組hepcidin的生理活性。研究發(fā)現(xiàn)重組hepc