畢赤酵母表達(dá)HBsAg的分離純化和鑒定.pdf

1、目的:(1)建立一套以柱層析為主的畢赤酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝，對(duì)HBsAg進(jìn)行生物學(xué)性質(zhì)鑒定;(2)制備重組畢赤酵母乙型肝炎疫苗，檢測(cè)重組乙型肝炎疫苗誘導(dǎo)小鼠抗體應(yīng)答。
　　 方法:(1)畢赤酵母GS115發(fā)酵液高速離心收集菌體，加入細(xì)胞裂解液乳化高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液經(jīng)聚乙二醇沉淀法澄清樣品，上清液調(diào)整pH值，電導(dǎo)率和自身濃度，DEAE陰離子交換層析，收集合格樣品進(jìn)行苯基疏水層析，超濾濃縮脫鹽，收集濃縮液，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)

2、濾分子篩層析收集純化終產(chǎn)品;(2) Western-blot免疫印跡和還原型SDS-PAGE銀染法檢測(cè)HBsAg特異性，掃描電鏡觀察HBsAg顆粒形態(tài)，ELISA法檢測(cè)HBsAg含量，高效凝膠分子篩液相方法檢測(cè)HBsAg純度;(3) AlCl3溶液緩慢恒速流加NaOH溶液制備Al(OH)3佐劑，純化終產(chǎn)品稀釋至一定濃度加入等體積的鋁佐劑攪拌混勻，制備終濃度為20μg/ml的疫苗成品;(4)腹腔注射BALB/c小鼠重組乙型肝炎疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)

3、生anti-HBs，眼內(nèi)眥靜脈采血，ELISA法檢測(cè)BALB/c小鼠血清中anti-HBs含量，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:(1) Western-blot免疫印跡和SDS-PAGE銀染見(jiàn)HBsAg特異性條帶，電鏡掃描見(jiàn)均一的平均直徑為22 nm球形顆粒，ELISA法檢測(cè)HBsAg含量為440μg/ml，高效凝膠分子篩液相檢測(cè)HBsAg純度超過(guò)95.0％;(2) Al(OH)3佐劑高壓滅

4、菌后均一穩(wěn)定，未出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，自制疫苗吸附率為99.995％，達(dá)到歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)，(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明自制疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的anti-HBs在第7周達(dá)到峰值163±7.384 U/L，與陽(yáng)性對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:(1)成功建立了一套以柱層析為主的畢赤酵母表達(dá)的HBsAg分離純化工藝，純化終產(chǎn)品生物學(xué)性質(zhì)符合歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn);(2)自制乙型肝炎疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高濃度的anti-HBs，其研發(fā)工藝具有進(jìn)一步生產(chǎn)