Salubrinal對模擬高原缺氧環(huán)境下大鼠右心室重構(gòu)保護作用的研究.pdf

1、研究背景與目的：長期暴露于高原缺氧環(huán)境，肺血管壁厚度會逐漸增加，管腔狹窄，引起肺動脈壓力升高。持續(xù)性的肺動脈高壓導致右心室肥厚、心肌纖維化，甚至右心衰竭的發(fā)生。缺氧是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激重要的觸發(fā)因素，本實驗擬探討模擬高原缺氧環(huán)境下肺動脈高壓和右心室重構(gòu)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑salubrinal對右心室重構(gòu)的預(yù)防及治療效果，并完成大鼠右心室組織的RNA-Seq測序，從轉(zhuǎn)錄水平全面評估salubrinal抗高原缺氧右心室損傷

2、的作用。
　　方法：（1）將24只大鼠隨機分為4組，放入低壓氧艙中，模擬海拔5500米的高原環(huán)境，分別飼養(yǎng)1，3，7，14 d，并設(shè)常壓常氧環(huán)境生活的大鼠作為對照，測量各實驗組大鼠的右心室收縮壓（RVSP）、平均肺動脈壓（mPAP）、右心室肥厚程度（RV/(LV+IS)和RV/BW）及肺血管壁中膜厚度（WT％），檢測血清中內(nèi)皮素（ET-1）、丙二醛（MDA）的表達水平和超氧化物歧化酶（SOD）的活力值。分別應(yīng)用western-bl

3、ot和實時定量PCR測量大鼠右心室組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記分子GRP78、calreticulin等蛋白及CHOP、caspase-12等mRNA的表達水平。
　?。?）將30只大鼠，隨機分為溶劑對照組、乙酰唑胺組及salubrinal組，在放入低壓氧艙（設(shè)置5500米的海拔高度）前半小時給藥，之后每天1次，另有12只大鼠（隨機分為溶劑對照組和 salubrinal組）放在同一房間常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。14天后測量各實驗組大鼠的RVSP

4、、mPAP、RV/(LV+IS)、RV/BW及WT%，檢測血清中ET-1、MDA的表達水平和SOD的活力值，分別應(yīng)用Masson染色和TUNEL染色檢測右心室心肌纖維化和細胞凋亡情況，應(yīng)用western-blot和實時定量 PCR測量大鼠右心室組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記分子 p-eIF2α/eIF2α、GRP78、calreticulin、CHOP和caspase-12等蛋白或mRNA的表達水平。
　　（3）將20只大鼠在低壓氧艙（設(shè)置

5、5500米的海拔高度）中飼養(yǎng)14天后，隨機分為溶劑對照組和salubrinal組，從第15天開始每天給藥1次，至第28天。另有10只大鼠放在同一房間常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。應(yīng)用超聲心動圖和血流動力學評價心臟的結(jié)構(gòu)和功能，計算RV/(LV+IS)、RV/BW及WT%，檢測血清中腦利鈉肽（BNP）和ET-1的表達水平，分別應(yīng)用Masson染色和TUNEL染色檢測右心室心肌纖維化和細胞凋亡情況。
　　（4）利用RNA-Seq技術(shù)對salub

6、rinal治療實驗中（常壓常氧對照組，溶劑對照組和salubrinal治療組）的大鼠右心室心肌組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選在不同組間差異表達的基因（DEGs），并對DEGs進行GO功能分析和KEGG pathway分析，以期得到與缺氧性肺動脈高壓和右心室重構(gòu)相關(guān)的基因和通路。
　　結(jié)果：（1）與常壓常氧大鼠相比，低壓氧艙中生活的大鼠體重明顯下降，心率明顯加快，血壓呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。隨著高原缺氧暴露時間的延長，RVSP、mPA

7、P、RV/(LV+IS)、RV/BW以及WT%均逐漸增加。大鼠血清中ET-1和MDA的表達水平明顯升高，SOD活力下降。高原缺氧條件下，右心室組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和calreticulin的表達量明顯增加，同時，GRP78及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡標記分子CHOP及caspase-12的mRNA表達水平也明顯上調(diào)。
　　（2）常壓常氧環(huán)境下，溶劑組和salubrinal組的的各項指標均無明顯差異，選取常氧溶劑組作為對照。在模擬高原

8、缺氧環(huán)境下飼養(yǎng)14天的大鼠，RVSP、mPAP、RV/(LV+IS)、RV/BW以及WT%均明顯升高，血清中ET-1、MDA的表達量升高，SOD活力降低，右心室膠原容積分數(shù)（CVF）和心肌細胞凋亡指數(shù)（AI）明顯增加，預(yù)防性給予 salubrinal的大鼠，以上各指標均有明顯改善。Western-blot結(jié)果提示：與常壓常氧大鼠相比，低壓低氧誘導了大鼠右心室心肌組織p-eIF2α蛋白的表達，給予salubrinal處理后，p-eIF2α

9、蛋白的表達量進一步增加。此外，salubrinal抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 GRP78和calreticulin蛋白的表達，并降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡分子CHOP和caspase-12蛋白及 mRNA的表達。
　　（3）與常壓常氧對照組相比，低壓低氧條件下，大鼠右心室游離壁厚度與體重比（RVAW/BW）明顯增加、肺動脈血流加速時間（PAAT）明顯縮短， RV/(LV+IS)、RV/BW、Lung/BW和 WT%升高。此外，大鼠的 RVSP

10、、mPAP及右心室+dP/dtmax明顯升高，RVEDP和-dP/dtmax明顯降低，血清中BNP和ET-1的表達量增加。與溶劑對照組相比，salubrinal治療組的各項指標均有所改善，但RVEDP和BNP的改變未見統(tǒng)計學差異。Salubrinal也明顯降低了缺氧誘導的右心室CVF和AI的增加。
　?。?）與對照組相比，溶劑組大鼠右心室中共有580個DEGs，與溶劑組相比，salubrinal治療組共有120個DEGs。這些基因

11、中，在溶劑組顯著表達同時受到 salubrinal修復(fù)的共有88個。GO功能顯著性富集分析顯示差異基因富集的生物學過程體現(xiàn)在氣體交換、過氧化氫代謝過程、活性氧代謝過程、活性氧反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育過程、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細胞生長和化學刺激等多個方面。顯著富集的信號通路主要包括瘧疾、p53信號通路、細胞周期、細胞外基質(zhì)受體相互作用、晝夜節(jié)律、焦點粘連以及花生四烯酸代謝等。
　　結(jié)論：（1）在高原缺氧誘導的肺動脈高壓和右心室重