酪氨酸去磷酸化增強(qiáng)表皮生長因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究.pdf

1、目的：
　　設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討PTPH1對(duì)TKI類藥物與ER拮抗劑聯(lián)合用藥效果的影響，并針對(duì)上述一系列設(shè)想建立了課題思路。
　　方法：
　　為了檢驗(yàn)上述假設(shè)，我們預(yù)先設(shè)計(jì)了三部分比較系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)。在第一部分實(shí)驗(yàn)中，選用PTPH1過表達(dá)癌細(xì)胞、正常表達(dá)PTPH1的同細(xì)胞系癌細(xì)胞以及PTPH1敲低癌細(xì)胞株進(jìn)行相關(guān)TKI抗癌藥物(拉帕替尼Lapatinib，吉非替尼Gefitinib)敏感性實(shí)驗(yàn)，以檢測PTPH1表達(dá)水平對(duì)所選擇藥

2、物抗癌效果的影響。在第二部分實(shí)驗(yàn)中，對(duì)相關(guān)細(xì)胞系進(jìn)行有條件的培養(yǎng)，隨后用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測PTPH1是否可以調(diào)節(jié)相關(guān)抗癌藥物的靶向蛋白EGFR蛋白水平、穩(wěn)定性以及相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化水平。最后第三部分研究計(jì)劃，包涵了一系列綜合實(shí)驗(yàn)，包括Western blot、免疫沉淀、核漿分離實(shí)驗(yàn)等對(duì)PTPH1調(diào)節(jié)EGFR的膜易位、ER的核內(nèi)易位以及ER與EGFR的相互作用進(jìn)行了研究分析，同時(shí)這部分實(shí)驗(yàn)可以綜合性地探討PTPH1是否能夠分別

3、調(diào)節(jié)EGFR蛋白水平和促進(jìn)ER轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而增強(qiáng)相關(guān)靶向治療藥物（TKI類藥物和他莫昔芬Tamoxifen）對(duì)乳腺癌細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用。上述實(shí)驗(yàn)構(gòu)成了一整個(gè)體系，探討PTPH1對(duì)TKI類藥物（以及與他莫昔芬聯(lián)合用藥）的敏感性調(diào)節(jié)及其原理。
　　結(jié)果：
　　1.PTPH1提升了乳腺癌細(xì)胞對(duì)TKI類藥物的敏感性:PTPH1表達(dá)水平的提高特異性增強(qiáng)了MCF7、T47D以及MDA-MB-231(231)細(xì)胞對(duì)TKI類藥物（拉帕

4、替尼和吉非替尼）的敏感性;而在同類細(xì)胞系當(dāng)中，如果PTPH1蛋白被敲低會(huì)下調(diào)TKI類藥物的效果——PTPH1水平降低之后細(xì)胞耐藥性出現(xiàn)。PTPH1水平?jīng)Q定了癌細(xì)胞對(duì)TK1類藥物的抵抗。
　　2.PTPH1可以對(duì)EGFR在Y1173位點(diǎn)上進(jìn)行去磷酸化。與PTPH1正常表達(dá)的對(duì)照組相比，PTPH1過表達(dá)細(xì)胞中Y1173位點(diǎn)的磷酸化水平明顯降低，而且這種去磷酸化作用也存在于體外293T細(xì)胞中;反之PTPH1敲低的細(xì)胞系的Y1173磷酸化

5、水平獲得上調(diào)。PTPH1對(duì)Y1173位點(diǎn)的去磷酸化依賴其自身催化能力，失去催化能力的PTPH1突變體PTPH1/S459A和PTPH1/DA沒有去磷酸化功能。
　　3.PTPH1可以上調(diào)EGFR蛋白表達(dá)水平:Western Blot證實(shí)在PTPH1過表達(dá)細(xì)胞中，EGFR的水平明顯高于PTPH1正常表達(dá)細(xì)胞;反之，癌細(xì)胞中的PTPH1敲低之后，EGFR水平隨之下降。PTPH1失去磷酸化功能的突變體PTPH1/S459A無法上調(diào)EGF

6、R蛋白。在體外293T細(xì)胞中，PTPH1上調(diào)EGFR蛋白的功能仍然存在。放線菌酮(Cycloheximide，CHX)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTPH1上調(diào)EGFR蛋白的原因主要為增強(qiáng)EGFR蛋白的穩(wěn)定性;EGFR的突變體EGFR/Y1173F存在不依賴PTPH1的高穩(wěn)定性;PTPH1的突變體 PTPH1/S459A無法提高EGFR蛋白的穩(wěn)定性。泛素實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTPH1過表達(dá)導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的EGFR蛋白降解減少;EGFR/Y1173F存在PTPH1非依賴性

7、泛素化降解減少。相關(guān)細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGFR過表達(dá)明顯提高TKI的藥物作用;PTPH1過表達(dá)提升TKI藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用;EGFR/Y1173F過表達(dá)導(dǎo)致了乳腺癌細(xì)胞對(duì)TKI藥物的耐藥性，而且這種耐藥性無法被PTPH1調(diào)節(jié)。最重要的是，免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)在臨床標(biāo)本中，PTPH1與EGFR蛋白水平呈明顯的正相關(guān)。
　　4.PTPH1可以降低EGFR與ER的相互作用。核漿分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTPH1不僅可以促進(jìn)核內(nèi)ER水平提高，而且促

8、進(jìn)了EGFR在細(xì)胞膜上的富集。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):PTPH1過表達(dá)可以降低EGFR與ER的結(jié)合，使EGFR-ER復(fù)合物水平降低;PTPH1/S459A無法降低EGFR與ER的相互作用。結(jié)合相關(guān)細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)我們推測，EGFR與ER的相互作用可影響TKI藥物的作用。
　　5.ER的核內(nèi)蛋白水平升高導(dǎo)致EGFR與ER的相互作用減弱。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):細(xì)胞質(zhì)中的ER可以與EGFR相結(jié)合，產(chǎn)生EGFR-ER復(fù)合物;ER的突變體ER/T311A

9、核內(nèi)蛋白降低，與EGFR產(chǎn)生的復(fù)合物增加。相關(guān)細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)顯示:ER/T311A過表達(dá)組與野生型ER過表達(dá)組相比，耐藥性增強(qiáng)。我們推測EGFR-ER復(fù)合物導(dǎo)致了細(xì)胞對(duì)TKI產(chǎn)生耐藥性。
　　6.PTPH1提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)TKI與他莫昔芬(TAM)聯(lián)合用藥的敏感性。細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)顯示:PTPH1過表達(dá)可以分別提高TKI類藥物或者他莫昔芬的作用;PTPH1過表達(dá)對(duì)于TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥效果的提升作用更為顯著;PTPH1的突變體一一沒

10、有去磷酸化作用的PTPH1/S459A無法提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥的敏感性。
　　結(jié)論：
　　1.PTPH1增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)TKI類藥物的敏感性。
　　2.PTPH1在體外細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中均可對(duì)EGFR在Y1173位點(diǎn)進(jìn)行去磷酸化。
　　3.PTPH1通過對(duì)EGFR的Y1173位點(diǎn)的去磷酸化增加EGFR的穩(wěn)定性。
　　4.PTPH1通過催化活性降低EGFR-ER復(fù)合體的水平，從而提高TKI