抗CD44粘附分子單克隆抗體對(duì)HL-60白血病細(xì)胞增殖及分化的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文抗CD44粘附分子單克隆抗體對(duì)HL60白血病細(xì)胞增殖及分化的影響及其機(jī)制探討姓名：郝洪嶺申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：董作仁20040401中文摘要觀察CD44單克隆抗體A3D8對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞增殖、分化的影響效應(yīng)，探討CD44分子途徑的作用機(jī)制，希望能為白血病的誘導(dǎo)分化治療提供一條新思路。方法：1細(xì)胞培養(yǎng)及CD44結(jié)合反應(yīng)將人AML—M2型細(xì)胞系IlL一60培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為15％的滅活胎牛血清、

2、100U／ml的青霉素和10099／ml硫酸鏈霉素的RPMll640培養(yǎng)液中，置37。C、體積分?jǐn)?shù)為5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色拒染率均在95％以上。將密度為1X105／ml的HL60細(xì)胞懸液接種在96孔平底培養(yǎng)板，每孔200gl，分別加入不同濃度的抗CD44單克隆抗體(克隆號(hào)A3D8，鼠IgGl)，常規(guī)培養(yǎng)6天，于不同時(shí)間收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)同時(shí)用相同濃度的同型對(duì)照抗體(小鼠

3、IgG，)作為對(duì)照組。2抗CD44單抗A308對(duì)HL60細(xì)胞增殖活性的影響21MTT實(shí)驗(yàn)將1X103／ml細(xì)胞懸液接種在96孔平底培養(yǎng)板，每孔200ul，分別加入終濃度為03、06、12和24gg／ml的A3D8進(jìn)行孵育。每個(gè)濃度接種3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1～6天。培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)每孔加入20u1MTT溶液，離心棄上清，加入200“l(fā)二甲基亞砜(DMSO)充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀測(cè)490nm處吸光度A值，繪制細(xì)胞生長曲線并計(jì)算增殖抑制率。22臺(tái)盼

4、藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)如上法將濃度為2扯∥ml的A3D8與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，連續(xù)6天，每天取適量細(xì)胞懸液混勻，025％臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)拒染的活細(xì)胞數(shù)并繪制生長曲線。23FCM檢測(cè)CD71表達(dá)收集A3D8(2pg／m1)孵育72小時(shí)的IlL60細(xì)胞1104個(gè)，加入lOlalFITC偶聯(lián)的CD71抗體，49C避光放置30分鐘，冷PBS沈滌后FCM檢測(cè)CD71陽性細(xì)胞百分比。3抗CD44單抗A3D8對(duì)HL60細(xì)胞髓系分化的影響31FCM檢測(cè)系別抗原表達(dá)變

5、化分別收集A3D8及對(duì)照抗體孵育的細(xì)胞并調(diào)整為5X105／ml，取細(xì)胞懸液各100“l(fā)，分別加入PE或FITC偶聯(lián)的抗CDllb、CDl4、CDl5單抗10pl，4℃避光放置30分鐘，冷PBS洗滌后FCM檢測(cè)各分化抗原表達(dá)陽性率。32光學(xué)顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察于不同時(shí)間收集A3D8孵育的IlL一60細(xì)胞，離心制片后WrightGiemsa染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。33NBT還原試驗(yàn)取A3D8作用的HL60細(xì)胞2105個(gè)，懸浮于700／