抗細胞間粘附分子1單克隆抗體的制備、鑒定以及初步應(yīng)用.pdf

1、細胞間粘附分子1(ICAM-1)是一種細胞表面單鏈糖蛋白,參與抗原識別、補體結(jié)合、細胞粘附功能?？扇苄约毎g粘附分子1(sICAM-1)為細胞表面ICAM-1脫落所形成,其表達是導致Graves'病發(fā)生的重要因素之一,并且其血清水平對于判斷Graves’病的停藥和復發(fā)具有重要意義。利用純品ICAM-1免疫小鼠制備得到抗ICAM-1的單克隆抗體,為進一步治療Graves’病奠定了基礎(chǔ),將會有一定的經(jīng)濟意義和臨床應(yīng)用前景。
　　 目

2、的:
　　 1.利用純品ICAM-1免疫小鼠制備得到具有生物活性的抗ICAM-1的單克隆抗體。
　　 2.利用抗ICAM-1的單克隆抗體,治療Graves’病模型小鼠。
　　 方法：
　　 1.用純品ICAM-1來免疫動物。將純品ICAM-1蛋白與佐劑混合腹腔注射BALB/C小鼠三次,每次間隔大約3周,取小鼠內(nèi)眥靜脈血測免疫效價,取效價高的小鼠尾靜脈注射加強免疫一次,三天后取小鼠脾細胞,與骨髓瘤細胞以5:

3、1的數(shù)量混合,在PEG(聚乙二醇)作用下進行細胞融合。一周后取細胞生長孔上清經(jīng)ELISA檢測抗體分泌情況,將陽性分泌孔擴大培養(yǎng)并進行亞克隆。三次亞克隆后,將單克隆孔細胞擴大培養(yǎng),進行雜交瘤細胞及單克隆抗體的鑒定,同時采用動物體內(nèi)誘生的方法大量制備單克隆抗體。最后用Protein G SepharoseTM4 Fast Flow(簡稱protein G)純化腹水得到抗ICAM-1的單克隆抗體。
　　 2.腹腔注射抗ICAM-1的單

4、克隆抗體治療Graves’病模型小鼠:6只,10ug/只,一共注射3次,每次間隔24小時,3天后檢測,比較治療前后小鼠血清T4和TRAb(以刺激性抗體TSAb為主)含量的變化,評價治療效果。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用純品ICAM-1免疫小鼠三次,經(jīng)三次基礎(chǔ)免疫后小鼠血清中的抗體效價可達到1:10000。融合后一周左右,雜交瘤細胞可生長至1/3～1/2培養(yǎng)孔面積時,取上清液經(jīng)EIASA檢測抗體分泌情況,篩選出4個陽性孔

5、,陽性O(shè)D405值均約2.0。將陽性孔擴大培養(yǎng)后進行三次亞克隆化,獲得單克隆,擴大培養(yǎng)后進行雜交瘤細胞及單克隆抗體的鑒定。雜交瘤細胞染色體分析發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目眾數(shù)為98-104。數(shù)目上接近兩種親代細胞染色體數(shù)目的總和,結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲點染色體,還有少數(shù)亞中部著絲點染色體。4株細胞分泌的單克隆抗體的免疫球蛋白類別均為IgG1型。動物體內(nèi)誘生的腹水中抗體效價均可達1:200000,Protein G純化腹水上清效價均可達1:200000,純

6、化后的單抗蛋白濃度為1.2 mg/ml,并均可與ICAM-1特異性結(jié)合。
　　 2.利用抗ICAM-1的單克隆抗體治療Graves'病模型小鼠6只,比較治療前后小鼠血清:1)T4治療前為36.63±3.64,治療后為20.12±2.15,兩者比較為t=7.945,p=0.001,差別具有統(tǒng)計學意義；2)TRAb以刺激性抗體TSAb為主,治療前為2.02±0.27,治療后為0.54±0.14,兩者比較為t=11.388,p=0,差