仁術(shù)健胃顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、仁術(shù)健胃顆粒在臨床上廣泛用于慢性萎縮性胃炎(ChronicAtrophicGastritis，CAG)的治療，治療效果很好。為了探討仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制，以便更好的服務(wù)臨床治療，為仁術(shù)健胃顆粒治療CAG獲得更滿意的效果。依據(jù)臨床上仁術(shù)健胃顆粒治療CAG脾氣虛證患者效果更優(yōu)，本課題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，建立CAG脾氣虛證大鼠模型，給予仁術(shù)健胃顆粒治療CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察仁術(shù)健胃顆粒對(duì)CAG脾氣虛證的藥效學(xué)作用。為了進(jìn)一

2、步探討仁術(shù)健胃顆粒的治療CAG癌前病變，培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，研究仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清對(duì)N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-Methyl-N-nitroso-N’-nitroguanidine，MNNG）致人胚胃粘膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞即MC的增殖、凋亡以及P16、Fas、Survivin表達(dá)的影響。
　　 第一部分使用MNNG和酒精，配合饑飽失常、破氣苦降、疲勞耗氣的多因素方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察多因素造模方法對(duì)CA

3、G脾氣虛證大鼠體重、體溫，脾臟指數(shù)，胃指數(shù)和胃部組織病理的影響，評(píng)價(jià)CAG脾氣虛證大鼠模型。結(jié)果：CAG脾氣虛證大鼠模型體重明顯低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證大鼠模型體重增長(zhǎng)率也明顯低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。CAG脾氣虛證大鼠模型脾臟重量低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證大鼠模型胃指數(shù)高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。多因素造模的方法會(huì)使大鼠體溫產(chǎn)生較大波動(dòng)

4、。
　　 CAG脾氣虛證大鼠模型胃部組織的病理改變?nèi)缦袤w數(shù)量，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體腸化，粘膜糜爛，及潰瘍形成等的積分?jǐn)?shù)高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。提示：MNNG和酒精，配合饑飽失常、破氣苦降、疲勞耗氣的方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，會(huì)造成大鼠機(jī)體多方面的改變和損傷，其中以胃部組織的病理改變，最能客觀表現(xiàn)CAG脾氣虛證大鼠模型的成功建立。
　　 第二部分給予CAG脾氣虛證大鼠模型仁術(shù)健胃顆粒進(jìn)行治療，觀察大鼠

5、胃粘膜破壞因子如內(nèi)皮素(ET)，一氧化氮合酶(NOS)，胃動(dòng)素(MTL)的變化，胃粘膜保護(hù)因子如胃泌素(GAS)，生長(zhǎng)抑素(SS)，分泌型免疫球蛋白(SIgA)的變化，以及胃部環(huán)氧合酶2(COX-2)，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)，探討仁術(shù)健胃顆粒對(duì)如上因子的影響。
　　 結(jié)果：(1)CAG脾氣虛證模型組的ET、NOS、MTL水平高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.05);仁術(shù)健胃顆粒12g

6、/kg劑量組的ET水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒6g/kg和3g/kg劑量組的NOS的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒12g/kg和6g/kg劑量組的MTL的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示：仁術(shù)健胃顆粒的治療，可以降低CAG脾氣虛證模型異常升高的胃粘膜破壞因子ET、NOS、MTL水平，使其接近或恢復(fù)正常水平。

7、　　 (2)CAG脾氣虛證大鼠模型GAS，SS和SIgA水平比正常組低，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組的GAS水平均比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒僅12g/kg劑量組SS水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒6g/kg,3g/kg劑量組的SIgA水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示

8、：仁術(shù)健胃顆粒的治療，能提高CAG脾氣虛證模型異常降低的胃粘膜保護(hù)因子GAS、SS、SIgA水平，使其接近或恢復(fù)正常水平。
　　 (3)CAG脾氣虛證大鼠模型的COX-2、MMP-2、EGFR表達(dá)均處于較高水平。仁術(shù)健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組均可以降低COX-2、MMP-2、EGFR的表達(dá)，與CAG脾氣虛證大鼠模型組比較，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示：仁術(shù)健胃顆粒的治療，可以降低CAG脾氣虛證模型

9、胃部組織COX-2、MMP-2和EGFR的表達(dá)。
　　 第三部分培養(yǎng)人胚胃粘膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞即MC，探討仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清的對(duì)MC的增殖和P16的表達(dá)影響，以及對(duì)MC的凋亡和Fas、survivin表達(dá)的影響。結(jié)果：仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的增殖數(shù)量低于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的P16蛋白表達(dá)高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)

10、。
　　 仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組-MC的凋亡率高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的Fas蛋白表達(dá)高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的Survivin蛋白表達(dá)高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)。提示：仁術(shù)健胃顆粒含藥血清可以抑制MC增殖，提高M(jìn)C的凋亡，提高M(jìn)C中P16的表達(dá)，提高Fas表達(dá)，

11、降低Survivin表達(dá)。
　　 結(jié)論：通過(guò)對(duì)大鼠胃組織的病理學(xué)檢查，可以判斷使用多因素法可以成功建立CAG脾氣虛證大鼠模型。
　　 仁術(shù)健胃顆粒可以調(diào)節(jié)CAG脾氣虛證模型異常變化的胃粘膜破壞因子ET、NOS、MTL和胃粘膜護(hù)因子GAS、SS、SIgA接近或恢復(fù)到正常水平，減少COX-2、MMP-2、EGFR的表達(dá)，起到治療和預(yù)防CAG的作用。
　　 仁術(shù)健胃顆?？梢砸种莆赴┘?xì)胞的增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制

12、與提高胃癌細(xì)胞P16的表達(dá)，提高胃癌細(xì)胞Fas的表達(dá)，降低胃癌細(xì)胞Survivin有緊密聯(lián)系。
　　 第一部分，慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型的建立
　　 目的：觀察多因素法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察CAG脾氣虛證大鼠體重的變化，脾臟和胃指數(shù)的變化，胃部組織病理形態(tài)學(xué)的改變。方法：采用N—甲基—N—硝基—N—亞硝基胍(MNNG)和40％乙醇灌胃建立大鼠慢性萎縮性胃炎(CAG)模型，同時(shí)采用破氣苦降，饑飽失常和疲勞的

13、方法進(jìn)一步建立CAG脾氣虛證大鼠模型。觀察CAG脾氣虛證大鼠不同時(shí)期病理形態(tài)學(xué)的改變。以170μg/mL的MNNG10mL/kg灌胃，150μg/mL的MNNG溶液給大鼠自由飲用,40%乙醇，2mL/只，每周2次，在此基礎(chǔ)上第5周采用破氣苦降，饑飽失常和疲勞的方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，連續(xù)10周。每2周隨機(jī)處死CAG脾氣虛證大鼠2只，取胃部組織進(jìn)行光鏡觀察。連續(xù)觀察CAG脾氣虛證大鼠模型的體重，實(shí)驗(yàn)?zāi)┯^察胃組織重量指數(shù)，脾重量指數(shù)

14、，制作胃組織病理切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：CAG脾氣虛證模型組大鼠體重低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證模型組脾臟重量低于正常組脾臟重量存在顯著性差異(p＜0.01)，CAG脾氣虛大鼠胃指數(shù)高于正常組胃指數(shù)存在顯著性差異(p＜0.01)，CAG脾氣虛證模型的胃組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜糜爛，及潰瘍數(shù)量和程度明顯高于正常組。結(jié)論：多因素法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，會(huì)造成胃部嚴(yán)重的炎癥，使胃粘膜糜爛，進(jìn)而發(fā)生粘膜萎縮和腸

15、化生，會(huì)影響大鼠體重的增加和臟器的正常功能。
　　 第二部分，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠的影響
　　 第一節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)體重和胃組織病理形態(tài)的影響
　　 目的：觀察仁術(shù)健胃顆粒對(duì)CAG脾氣虛證大鼠體重，胃和脾臟器指數(shù)，胃組織病理形態(tài)的影響。方法：復(fù)制CAG脾氣虛證大鼠模型，隨機(jī)分為相應(yīng)各組，給予仁術(shù)健胃顆粒以及胃復(fù)春進(jìn)行治療，連續(xù)觀察大鼠的體重和體溫的變化，實(shí)驗(yàn)?zāi)?duì)胃組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果：C

16、AG脾氣虛證模型組大鼠體重低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)仁術(shù)健胃顆粒治療各組可以增加大鼠體重與模型組比較，存在顯著性差異(p＜0.01)。結(jié)論：MNNG和酒精影響大鼠的生長(zhǎng)，會(huì)使體重增加緩慢，體溫波動(dòng)大，仁術(shù)健胃顆粒能改善CAG脾氣虛證大鼠的生長(zhǎng)，增加體重，減小體溫波動(dòng)。
　　 第二節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)胃粘膜破壞因子ET、NOS和MTL的影響
　　 目的：通過(guò)觀察仁術(shù)健胃顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠內(nèi)皮素(

17、ET)，一氧化氮合酶(NOS)和胃動(dòng)素(MTL)的影響，探討仁術(shù)健胃顆粒預(yù)防和治療慢性萎縮性胃炎的機(jī)制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，饑飽失常，疲勞運(yùn)動(dòng)相結(jié)合的方法復(fù)制CAG脾氣虛證模型。實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè)CAG脾氣虛證模型組大鼠血清中的ET，NOS和MTL的水平。結(jié)果：CAG脾氣虛證模型組大鼠ET，NOS和MTL水平高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒12g/kg劑量組的ET水平低于CA

18、G脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒6g/kg和3g/kg劑量組的NOS的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術(shù)健胃顆粒12g/kg和6g/kg劑量組的MTL的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)論：CAG脾氣虛證通過(guò)仁術(shù)健胃顆粒治的治療，可以降低異常升高的胃粘膜破壞因子ET、NOS和MTL水平，使其接近或回復(fù)正常水平。
　　 第三節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒

19、對(duì)胃粘膜保護(hù)因子GAS、SS和SIgA的影響
　　 目的：通過(guò)觀察仁術(shù)健胃顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎(CAG)脾氣虛證大鼠胃泌素(GAS)，生長(zhǎng)抑素(SS)和分泌型免疫球蛋白(SIgA)的影響，探討仁術(shù)健胃顆粒預(yù)防和治療慢性萎縮性胃炎的機(jī)制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，破氣苦降，饑飽失常，疲勞運(yùn)動(dòng)相結(jié)合的方法復(fù)制CAG脾氣虛證證模型。然后將CAG脾氣虛證證模型大鼠隨機(jī)分為相應(yīng)各組。實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè)各組大

20、鼠的GAS，SS和SIgA的水平。結(jié)果：CAG脾氣虛證大鼠模型GAS，SS和SIgA水平比正常組低，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組的GAS水平均比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒12g/kg劑量組SS水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒6g/kg,3g/kg劑量組的SIgA水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差

21、異(p＜0.05)。結(jié)論：仁術(shù)健胃顆粒能夠提高胃粘膜保護(hù)因子GAS，SS和SIgA水平，起到保護(hù)胃粘膜防止胃炎的惡化作用。
　　 第四節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)胃組織COX-2、MMP-2和EGFR的影響
　　 目的：通過(guò)觀察仁術(shù)健胃顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎(CAG)脾氣虛證大鼠COX-2，MMP-2，EGFR的影響，探討仁術(shù)健胃顆粒預(yù)防和治療慢性萎縮性胃炎的機(jī)制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，破

22、氣苦降，饑飽失常，疲勞運(yùn)動(dòng)相結(jié)合的方法復(fù)制CAG脾氣虛證模型。然后將CAG脾氣虛證模型大鼠隨機(jī)分為相應(yīng)各組。實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè)各組大鼠的COX-2，MMPs-2，EGFR的表達(dá)。結(jié)果：CAG脾氣虛證大鼠模型組的COX-2，MMPs-2，EGFR表達(dá)均處于較高水平。CAG脾氣虛證大鼠模型組COX-2在腺體細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯，整個(gè)粘膜都呈現(xiàn)深棕黃色，為棕黃色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；CAG脾氣虛證大鼠模型組MMP-2在粘膜中表達(dá)明顯，整個(gè)粘膜都呈現(xiàn)深

23、棕黃色；CAG脾氣虛證大鼠模型組EGFR表達(dá)明顯，從基底部到粘膜表層，范圍廣，呈現(xiàn)深棕色。仁術(shù)健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組均可以降低COX-2，MMPs-2，EGFR的表達(dá)，與CAG脾氣虛證大鼠模型組存在顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)論：仁術(shù)健胃顆?？梢越档臀覆拷M織COX-2、MMPs-2和EGFR的表達(dá)，起到預(yù)防癌變的作用。
　　 第三部分，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)MC的影響
　　 第一節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)M

24、C的增殖和P16表達(dá)的影響
　　 目的：觀察仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清對(duì)MC的增殖和P16表達(dá)的影響。方法：使用仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清，培養(yǎng)MC，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞P16表達(dá)的情況。結(jié)果：仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的增殖數(shù)量低于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)。仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組均能顯著提高M(jìn)C的P16蛋白表達(dá)，與生理鹽水組比較存在顯著性差異(P＜0.0

25、5)。結(jié)論：仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清能明顯抑制MC的增殖數(shù)量，提高M(jìn)C的P16表達(dá)水平。
　　 第二節(jié)，仁術(shù)健胃顆粒對(duì)MC的凋亡與Fas、Survivin的影響
　　 目的：觀察仁術(shù)健胃顆粒兔含藥血清對(duì)MC的凋亡和Fas、Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法：使流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)MC的凋亡，運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)Fas、Survivin蛋白表達(dá)。結(jié)果：仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC