銀杏葉提取物EGb761抗谷氨酸興奮毒性作用與Snk-SPAR途徑的相關性研究.pdf

1、谷氨酸誘導的興奮毒性過程被認為與中風、癲癇、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化等重大神經系統(tǒng)疾患的發(fā)生發(fā)展有關，而離子型谷氨酸受體——N-甲基-D-門冬氨酸受體 (N-methyl-D-asparate receptor，NMDAR)在此過程中起最主要的作用。人們試圖通過干預谷氨酸興奮毒性損傷過程中的不同環(huán)節(jié)來實現神經保護與損傷修復的目的，但結果均不盡人意?？古d奮毒性研究急需找到新的靶點。在這種情況下，一個可望產生神經保護與神經發(fā)生調控雙重效

2、應的新的重要靶點便是血清誘導激酶(serum-inducible kinase，Snk)-樹突棘相關的Rap特異性GTPase活化蛋白 (spine-asSOCiated Rap guanosine triphosphatase (GTPase)activating protein，sPAR)途徑對興奮性突觸傳遞中樹突棘的調控。興奮性谷氨酸能突觸的突觸后結構約有90﹪位于樹突棘上，樹突棘構成了哺乳動物中樞神經系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的原始位點

3、，是學習和記憶活動的生物學基礎。SPAR位于樹突棘的突觸后致密區(qū)(postsynaptic density，PSD)中，與NMDAR與腳手架蛋白PSD-95組成復合體，是調節(jié)活動依賴性突觸重構的重要蛋白之一，并與樹突棘的成熟及形態(tài)的維持密切相關。近來發(fā)現,神經元活化時，被誘導產生的Snk可以使SPAR蛋白磷酸化和降解，最終導致樹突棘結構的失穩(wěn)定。因此，Snk-SPAR信號途徑可能會通過調控樹突棘的穩(wěn)定性在一定或較大程度上參與中樞神經系統(tǒng)

4、興奮毒性損傷過程，然而目前我們對此領域還一無所知。 銀杏葉提取物是一種含有黃酮類和萜內酯等多種活性成分的混合物，具有抗氧化和清除自由基、抑制由缺血引起的神經細胞凋亡、抑制和消除β淀粉樣蛋白(β-amyloid)的聚積、影響神經遞質轉運等功能，臨床上已廣泛應用于治療中風、記憶力減退、癡呆以及其他動脈閉塞性疾病，但其相關的作用機制卻仍未完全闡明。 本課題的目的在于觀察谷氨酸誘導大鼠海馬神經元興奮毒性損傷與Snk-SPAR途徑

5、之間的關系，并研究興奮毒性過程中銀杏葉提取物EGb761對Snk-SPAR途徑的干預及其對樹突棘形態(tài)的調節(jié)作用，不僅探討了銀杏葉提取物抗興奮毒性神經保護作用的分子機制，更可望為神經保護/神經發(fā)生調控提供新的策略和手段。 方法： 對體外培養(yǎng)18d的原代大鼠海馬神經元給予終濃度100μM谷氨酸和10μM甘氨酸，采用臺盼藍染色、熒光TUNEL及LDH檢測方法，觀察谷氨酸對神經元的損傷情況。在谷氨酸誘導興奮毒性損傷模型中，通過R

6、T-PCR方法檢測．Snk/SPA尺在mRNA水平的表達變化，蛋白質免疫印跡方法觀察Snk/SPAR在蛋白質水平的表達變化。用EGb761和MK-801預處理海馬神經元，通過臺盼藍染色、熒光TUNEL和LDH檢測法觀察EGb761 和MK-801 對海馬神經元興奮毒性損傷的保護效應，并通過RT-PCR、蛋白質免疫印跡、熒光原位雜交和雙重熒光標記的方法，分別在mRNA和蛋白質水平觀察EGb761 和MK-801 預處理對谷氨酸刺激后所誘導

7、的海馬神經元中Snk/SPAR的表達水平及分布變化的影響。通過海馬神經元綠色熒光蛋白質粒轉染的方法觀察EGb761和MK-801預處理對谷氨酸興奮毒性模型中神經元樹突棘損傷的保護作用。 結果： 一．谷氨酸誘導的大鼠海馬神經元興奮毒性損傷中Snk/SPAR表達水平的變化(一)體外培養(yǎng)18d的原代大鼠海馬神經元加入100μM谷氨酸和10μM甘氨酸處理10min，18h后檢測神經元死亡率為35﹪，凋亡率為37.2﹪，損傷程度是

8、正常組的3.1倍。 (二)神經元基礎狀態(tài)下 Snk mRNA水平較低，經100μM 谷氨酸和10μM甘氨酸處理10min后，1h即可出現表達水平升高，6h達高峰，約為基礎水平的4.2倍，隨后逐漸下降，12h左右回到基線水平。而基礎狀態(tài)下 SPAR mRNA水平較高，當谷氨酸刺激后，隨著Snk mRNA表達水平的增高而表達減少，到6h達到最低，約為基礎水平的34﹪，此后逐漸恢復。 (三)在蛋白質水平，Snk在正常神經元中很難被檢測

9、到，而SPAR表達豐富。谷氨酸刺激后3h，Snk的表達開始緩慢增強，一直持續(xù)到36h達最高峰，約是基礎水平的3.3倍，此后開始下降；與mRNA水平一致，谷氨酸刺激后，SPAR的變化趨勢與Snk相反，但變化的幅度大于前者，至谷氨酸刺激后36h已基本檢測不到。 二.銀杏葉提取物EGb761抗谷氨酸興奮毒性作用中Snk-SPAR途徑機制探討(一)在谷氨酸誘導海馬神經元興奮毒性損傷中，EGb761與MK-801預處理均有神經元保護作用。

10、EGb761和MK-801預處理組神經元與谷氨酸組神經元相比，死亡率分別降低了31.4﹪和67.8﹪，凋亡率分別降低了37.8﹪和68.2﹪，LDH漏出量分別降低了32.6﹪和60.6﹪。 (二)谷氨酸刺激后6h，EGb761與MK-801預處理組同谷氨酸組相比，Snk mRNA水平分別下降了約39﹪和46﹪，而SPAR mRNA水平上升了約47﹪和65﹪。 (三)谷氨酸刺激后36h，EGb761和MK-801預處理組的

11、Snk水平比谷氨酸組分別降低了48.7﹪和52.5﹪，而SPAR水平也分別上升到了正常組的66.1﹪和72.4﹪。 (四)EGb761與MK-801預處理可以對谷氨酸誘導興奮毒性過程中神經元突起上Snk分布增多及其所導致的SPAR分布減少有明顯的阻斷作用。 (五)谷氨酸誘導的興奮毒性作用對海馬神經元的樹突棘結構有明顯的損傷作用，表現為樹突棘的退化消失、樹突干的靜脈曲張樣改變等，樹突棘的數量比正常組減少了約70.5﹪，而E

12、Gb761與MK-801預處理可以明顯改善谷氨酸對樹突棘的損傷情況，與谷氨酸組相比，樹突棘的數量分別增長了56.7﹪和60.6﹪。 結論： 一.谷氨酸誘導的興奮毒性損傷可以導致Snk/SPAR在mRNA和蛋白質水平的表達變化，提示谷氨酸興奮毒性過程與Snk-SPAR途徑密切相關。 二.EGb761預處理給藥有顯著的抗谷氨酸興奮毒性作用，但此作用不如MK-801明顯。 三．在谷氨酸興奮毒性過程中，無論在mR

13、NA水平還是蛋白質水平，EGb761 預處理給藥可以明顯干預Snk/SPAR表達水平的變化，并對谷氨酸刺激所導致的Snk/SPAR的在神經元上的分布變化有顯著影響，提示EGb76 l抗興奮毒性作用機制與調節(jié)Snk-SPAR途徑的信號傳遞有關。 四．谷氨酸誘導的興奮毒性作用對海馬神經元的樹突棘結構有明顯的損傷作用，可能與激活Snk-SPAR途徑有關。 五．EGb761 預處理可以明顯改善谷氨酸對樹突棘的損傷情況，其維持樹突