TFDP3的表達(dá)調(diào)控及其對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)在男性腫瘤中具有很高的發(fā)病率,在美國(guó)已成為男性癌癥死因中僅次于肺癌的第二大殺手[1]。傳統(tǒng)的臨床前列腺癌治療方法包括雄激素阻斷治療、手術(shù)治療和藥物去勢(shì)治療等。但是隨著時(shí)間的推移,幾乎全部患者的前列腺癌類型都將由激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)榉且蕾囆?也就是激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC),使得原本激素依賴性的癌細(xì)胞增殖加速而不受

2、低雄激素水平抑制,最終促進(jìn)了前列腺癌的進(jìn)展或轉(zhuǎn)移。到目前為止,對(duì)AIPC還尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療辦法。但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,基因治療將有望成為癌癥治療的新的有效手段。因此闡明前列腺癌的分子發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理具有重要的科學(xué)和臨床意義。
　　TFDP3是一個(gè)新的E2F1的直接調(diào)控因子。本課題組前期應(yīng)用組織芯片和原位雜交方法進(jìn)行了正常組織和癌組織的TFDP3表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)證明,該基因并非所謂的睪丸/腫瘤特異的癌基因,而是廣泛表達(dá)于

3、多種組織細(xì)胞。同時(shí),它的確在多種癌組織中表達(dá)增強(qiáng),尤其是相對(duì)于正常情況下不表達(dá)TFDP3的肝和前列腺組織中。研究表明TFDP3不僅可以抑制E2F1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性,而且可以抑制E2F1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用;可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的自噬作用;提高激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCap的生存能力。TFDP3誘導(dǎo)的自噬功能和抗凋亡效應(yīng)極有可能是前列腺癌由激素依賴性向非依賴性轉(zhuǎn)變過(guò)程中的關(guān)鍵的自我保護(hù)機(jī)制之一。
　　本研究通過(guò)進(jìn)一步對(duì)TFDP3

4、啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的分析,發(fā)現(xiàn)TFDP3可能與E2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,本課題首先我們構(gòu)建了包含TFDP3基因啟動(dòng)子的熒光報(bào)告載體,從啟動(dòng)子水平證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子E2F1對(duì)TFDP3的調(diào)控作用,其次通過(guò)western-blot初步探索TFDP3在E2F1刺激下的蛋白水平的變化,并且利用流式細(xì)胞術(shù)在功能水平上證實(shí)了TFDP3與E2F1的相互作用對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡所造成的影響。最后,通過(guò)免疫組化分析前列腺癌組織和正常組織中TFDP3和

5、E2F1的表達(dá)水平,證明TFDP3和E2F1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平相較于正常組織的表達(dá)水平均增高;同時(shí),隨著前列腺癌等級(jí)的增高,二者的表達(dá)水平也增強(qiáng),并且增高的趨勢(shì)相一致。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.首先,通過(guò)NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查找到TFDP3基因ATG上游約1064bp序列,并針對(duì)此序列設(shè)計(jì)引物。以人的前列腺癌PC3細(xì)胞基因組DNA為模板,采用 PCR技術(shù)擴(kuò)增TFDP3啟動(dòng)子片段并克隆到 pGL3-Basic熒

6、光素酶報(bào)告基因上游多克隆位點(diǎn)處,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建包含 TFDP3基因啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的重組載體pGL3-TFDP3-promoter。最后,將構(gòu)建的重組載體 pGL3-TFDP3-promoter轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞后,檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性,以驗(yàn)證克隆的片斷存在TFDP3的啟動(dòng)子序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
　　進(jìn)一步與E2F1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后,TFDP3啟動(dòng)子誘導(dǎo)的熒光素酶活性較單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGL3-TFDP3-promote

7、r顯著升高(1.14±0.06 vs0.61±0.05,P<0.05),證明E2F1可誘導(dǎo)TFDP3轉(zhuǎn)錄。
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染E2F1表達(dá)載體pCMV-E2F1-HA于PC3細(xì)胞中,提取蛋白后,經(jīng)Western blot檢測(cè),得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:相比未轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染E2F1表達(dá)載體組的E2F1和TFDP3的表達(dá)均有所增加,IOD(TFDP3)/IOD(β-actin)約增加2.7倍(0.089±0.02vs0.24±0.03,P<0.0

8、5)?？梢?jiàn)E2F1對(duì)TFDP3的蛋白表達(dá)具有上調(diào)作用。
　　3.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) TFDP3與 E2F1相互作用對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響可以發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染 E2F1表達(dá)載體后細(xì)胞凋亡率顯著上升(2.66％±0.001 vs7.1%±0.003,P<0.05),而與pcDNA3.1-TFDP3共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率明顯下降(7.1%±0.003 vs4.92%±0.002,P<0.05)。因此,進(jìn)一步驗(yàn)證了TFDP3可以在一定程度上抑制由

9、 E2F1誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡。
　　4.通過(guò)免疫組化檢測(cè)前列腺癌組織標(biāo)本以及正常前列腺組織標(biāo)本中 TFDP3和E2F1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:相較正常前列腺組織,前列腺癌組織中TFDP3和E2F1的表達(dá)水平均增強(qiáng),同時(shí)隨著前列腺癌等級(jí)的增高,TFDP3和E2F1的表達(dá)也隨之增長(zhǎng),并且二者的增長(zhǎng)趨勢(shì)相一致。
　　綜上所述,本研究通過(guò)構(gòu)建TFDP3啟動(dòng)子區(qū)熒光報(bào)告載體pGL3-TFDP3-promoter,并利用雙熒光素酶檢測(cè)

10、系統(tǒng)及 Western blot初步確定E2F1對(duì)TFDP3基因啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平的調(diào)控作用,證明了E2F1參與該基因表達(dá)調(diào)控。此外通過(guò)免疫組化檢測(cè)正常前列腺組織和前列腺癌組織中TFDP3和E2F1表達(dá)水平,并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)TFDP3可以結(jié)合E2F1進(jìn)而有效抑制前列腺癌細(xì)胞的凋亡,從而在保障前列腺癌細(xì)胞生存中發(fā)揮了重要作用。這一現(xiàn)象提示TFDP3可能通過(guò)抑制激素缺失條件下前列腺細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生存。