siRNA靶向沉默Akt1基因?qū)η傲邢侔〥U145、PC3細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：使用siRNA抑制Akt1基因的表達，篩選有效的干擾序列，觀察Akt1基因的沉默對DU145、PC3細胞的增殖、凋亡的影響。為針對Akt1基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)提供新的有效作用靶位，為針對Akt1的前列腺癌基因治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：1.設(shè)計并體外化學合成3對針對Akt1基因的特異性siRNA與1對綠色熒光標記的FAM-siRNA作為陰性對照。
　　2.使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將F

2、AM-siRNA轉(zhuǎn)染入前列腺癌DU145、PC3細胞，熒光顯微鏡下觀測siRNA的轉(zhuǎn)染效率。利用RT-PCR和Western Blot法分別檢測各組細胞、Akt1 mRNA及蛋白的表達。計算表達率，選取具有最大抑制作用的siRNA作為最佳干擾序列。
　　3.將最佳干擾序列siRNA轉(zhuǎn)染入前列腺癌DU145、PC3細胞。用CCK-8(Cellcounting kit-8)法檢測siRNA對DU145、PC3細胞增殖的影響，Annex

3、in V-PI法檢測siRNA對細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下觀測，F(xiàn)AM-siRNA轉(zhuǎn)染DU145、PC3細胞效率分別為72％，69％; RT-PCR結(jié)果顯示，兩株細胞轉(zhuǎn)染Akt1-siRNA的各組的Akt1mRNA表達水平均低于陰性對照組與空白組，均為siRNA-3轉(zhuǎn)染組作用最明顯，DU145細胞siRNA-3轉(zhuǎn)染組Akt1 mRNA表達率為(27.1±4.2)％，PC3細胞siRNA-3轉(zhuǎn)染組Akt1 mRNA表達

4、率為(20.6±5.4)％;Western-blot法檢測DU145、PC3細胞siRNA-3組Akt1蛋白的表達率分別為(63.1±4.9)％、(50.9±6.6)％;CCK-8檢測結(jié)果顯示，兩株細胞siRNA-3轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的相對增殖率與空白對照組及陰性對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;流式細胞儀技術(shù)測轉(zhuǎn)染后48h各組細胞凋亡率，結(jié)果顯示:DU145細胞siRNA-3組細胞凋亡率為(27.63±1.31

5、)％，空白組和NC組細胞凋亡率分別為(16.15±0.19)％和(14.67±0.22)％，siRNA-3組較空白組和NC組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而空白組和NC組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); PC3細胞siRNA-3組細胞凋亡率為(26.93±1.34)％，空白組和NC組細胞凋亡率分別為(15.72±0.20)％和(16.84±0.19)％，siRNA-3組較空白組和NC組細胞凋亡率顯著升