miRNA let-7a-1對前列腺癌PC-3細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、microRNAs(miRNA)是一類長約22核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子。它們參與細胞中各種基本生命過程的調(diào)控，包括發(fā)育、凋亡和細胞增殖，甚至是癌癥發(fā)生。miRNA可以直接導致mRNA的降解或在轉錄后水平調(diào)控mRNA的翻譯。miRNA let-7a-1的異常表達與腫瘤的發(fā)生密切相關。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAlet-7a-1在前列腺癌細胞中異常低表達，異源高表達miRNA let-7a-1能夠有效地調(diào)控IGF-1R介導的信號通路，抑制

2、前列腺癌PC-3細胞的增殖，促進其凋亡。
　　 本研究開展了miRNA let-7a-1影響前列腺癌PC-3細胞增殖和凋亡的分子機制研究。(1)首先構建miRNA let-7a-1真核表達載體pSilencer-let-7a-1，轉染前列腺癌細胞PC-3細胞，利用RT-PCR檢測該表達載體的表達效率。(2)構建miRNAlet-7a-1靶序列-報道基因融合質粒pMIR-Report-let-7a-1T，熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測了

3、pre-let-7a-1的表達及其成熟miRNA let-7a-1的作用，采用MTT比色法、流式細胞術和Hoechst33258細胞染色檢測了miRNA let-7a-1對前列腺癌PC-3細胞增殖和凋亡的影響，進一步確定miRNA let-7a-1的表達及其生物學活性。(3)pSilencer-let-7a-1轉染前列腺癌細胞PC-3細胞，利用RT-PCR和Western blotting分別檢測了miRNA let-7a-1過表達對靶

4、基因IGF-1R和Bcl2 mRNA及蛋白質表達的影響。(4)構建了IGF-1R-3UTR熒光素酶報告基因質粒，將熒光素酶報道基因質粒與pSilencer-let-7a-l真核表達載體共轉染PC-3細胞，熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miRNA let-7a-1與靶基因3UTR結合位點的作用。(5)IGF-1處理PC-3細胞后，MTT比色法進一步驗證miRNA let-7a-1過表達下調(diào)IGF-1R，阻斷IGF-1R信號通路，抑制前列腺癌PC

5、-3細胞的增殖。(6)構建了ELK-1熒光素酶報告基因質粒(pGL4-ELK-1)，與pSilencer-let-7a-1真核表達載體共轉染PC-3細胞，IGF-l處理后，熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miRNA let-7a-1過表達對IGF-1R細胞增殖信號通路的影響，RT-PCR和Western blotting分別檢測了miRNAlet-7a-1過表達對IGF-1R信號通路靶基因c-fos表達的影響。(7)RT-PCR檢測miRNAl

6、et-7a-1過表達對增殖凋亡相關基因表達的影響。
　　 結果：(1)成功構建了miRNA let-7a-1真核表達載體pSilencer-let-7a-1，瞬時轉染PC-3細胞后能有效表達。MTT比色法和流式細胞術證實了miRNA let-7a-1能抑制前列腺癌PC-3細胞增殖，促進其凋亡。(2)成功構建了pMIR-Report-let-7a-1T報告基因融合質粒，經(jīng)DNA測序正確。(3)RT-PCR和Western blot

7、ting結果表明，miRNAlet-7a-1過表達有效抑制靶基因IGF-1R mRNA及蛋白質的表達。(4)成功構建了IGF-1R-3UTR熒光素酶報告基因質粒，與pSilencer-let-7a-1真核表達載體共轉染PC-3細胞，熒光素酶報告基因活性明顯降低，表明miRNA let-7a-1過表達可直接作用于IGF-1R-3UTR的靶序列，下調(diào)靶基因IGF-1R的表達。(5)IGF-1處理PC-3細胞后，MTT比色法結果顯示miRNA

8、 let-7a-l能有效抑制IGF-1對前列腺癌PC-3細胞增殖的刺激作用；ELK-1熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miRNAlet-7a-1可抑制IGF-1R細胞增殖信號通路；RT-PCR和Western blotting結果顯示，miRNA let-7a-1可使IGF-1R信號通路靶基因c-fos mRNA及蛋白質表達水平下降。(6)RT-PCR結果顯示，miRNA let-7a-1下調(diào)Cyclin-E、Cyclin-D、CDK6的

9、mRNA的表達，上調(diào)P27mRNA的表達。
　　 結論：本研究結果表明，miRNA let-7a-1可直接作用于靶基因IGF-1R的3UTR靶序列，下調(diào)IGF-1R的表達，從而抑制IGF-1R信號通路對前列腺癌細胞的促增殖抗凋亡作用。另外，miRNA let-7a-1還可間接作用于細胞周期調(diào)節(jié)因子Cylin-E、Cyclin-D、CDK6和P27的表達，影響前列腺癌細胞的增殖。這一研究結果為深入研究miRNA let-7a-1在