慢性阻塞性肺疾病呼吸道粘液纖毛清除功能與細(xì)菌感染相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種慢性進(jìn)展惡化的炎癥性疾病,由多因素致病。COPD的反復(fù)急性加重將會(huì)導(dǎo)致肺功能進(jìn)一步減退,加重氣道炎癥并增加病死率。感染和非感染因素都會(huì)引起COPD急性加重,其中氣道粘液高分泌和細(xì)菌感染是COPD加重的常見原因。近期研究結(jié)果顯示吸煙小鼠對銅綠假單胞菌的清除減低,延遲清除伴隨臨床表現(xiàn)惡化和氣道炎癥增加。但該實(shí)驗(yàn)

2、發(fā)現(xiàn)吸煙不影響巨噬細(xì)胞的吞噬活性,表明有不依賴于吞噬機(jī)制導(dǎo)致的銅綠假單胞菌清除延遲。吸煙也降低支氣管肺泡灌洗液中的SPA。缺乏SPA小鼠較野生型小鼠銅綠假單胞菌感染后具有更多的細(xì)菌負(fù)荷,同時(shí)伴有增加的TNF-α。
　　 COPD宿主固有防御受損,最重要的是粘液纖毛清除功能(Mucociliaryclearance,MCC)功能減低。MCC在COPD發(fā)病中的作用日益引起人們的重視。MCC主要是由纖毛和粘液組成,它是呼吸系統(tǒng)的重要防

3、御機(jī)制之一,它主要通過纖毛擺動(dòng)對粘液的清除,從而把吸附在粘液中的細(xì)菌等微生物排出體外。COPD時(shí),MCC異常,導(dǎo)致粘液潴留,氣流受限及細(xì)菌感染,可以引起COPD急性加重。但目前缺乏合適的動(dòng)物模型能同時(shí)觀察COPD肺的清除功能及呼吸道MCC功能。
　　 標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油是一種從植物中提取的脂溶性揮發(fā)油,其主要成分是桉油素、檸檬烯和α-蒎烯。它能增強(qiáng)黏液纖毛清除功能,并有一定的抗炎作用。國外臨床研究表明標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油可以防止COPD患者氣

4、道阻塞,減少急性發(fā)作次數(shù)。但其作用機(jī)制尚不清楚。粘液高分泌是氣道阻塞的重要原因,而細(xì)菌感染是COPD急性加重的主要誘因。由此,我們設(shè)想標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油是否通過減少氣道粘液分泌、改善MCC功能來促進(jìn)下呼吸道細(xì)菌的清除,從而減輕氣道阻塞、減少肺內(nèi)細(xì)菌定植。
　　 吸煙被認(rèn)為是COPD發(fā)病的最主要危險(xiǎn)因素。有研究表明吸煙損傷纖毛結(jié)構(gòu)及功能、導(dǎo)致粘液高分泌,影響粘液纖毛清除功能,感染病原體不能被有效清除,從而放大免疫炎癥反應(yīng),促進(jìn)中性粒細(xì)胞

5、釋放彈性蛋白酶,氧化劑及金屬蛋白酶等引起組織破壞及增加粘蛋白分泌,促進(jìn)COPD的發(fā)生和發(fā)展。吸煙可刺激單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥因子、趨化因子及細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等。炎性介質(zhì)在啟動(dòng)和維持粘蛋白高分泌中起重要作用。已經(jīng)證實(shí)TNF-α導(dǎo)致氣道粘蛋白表達(dá)增加。NF-κB是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族的組成部分,調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)基因的表達(dá)。在吸煙導(dǎo)致粘蛋白高分泌中,NF-κB是重要的信號通路。
　　

6、 本實(shí)驗(yàn)我們采用被動(dòng)吸煙的方法建立COPD大鼠模型來研究吸煙對粘液纖毛傳輸系統(tǒng)的影響;觀察COPD大鼠PA感染后細(xì)菌清除和免疫炎癥反應(yīng)過程;同時(shí)給予標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油進(jìn)行干預(yù),觀察標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油在下呼吸道細(xì)菌清除、氣道炎癥及黏蛋白高分泌中的作用;并進(jìn)一步探討標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油參與氣道細(xì)菌清除及粘液高分泌的分子機(jī)制,為COPD的防治提供了一個(gè)新的視角。
　　 方法:
　　 1、Wistar大鼠隨機(jī)分組,采用被動(dòng)吸煙12周的方法建立COP

7、D大鼠模型。對照組不做任何干預(yù)。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組于每日吸煙前給予標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油灌胃治療至第12周末。
　　 2、用HE染色評估肺部病理改變及形態(tài)學(xué)測量。
　　 3、小動(dòng)物肺功能儀測定大鼠肺功能。
　　 4、掃描電鏡觀察大鼠氣道纖毛形態(tài)學(xué)。
　　 5、99mTc-SC氣溶膠顯像測定氣道MCC功能。
　　 6、制備大鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型。
　　 7、行支氣管肺泡灌洗計(jì)數(shù)白細(xì)胞及菌落數(shù)。

8、>　　 8、用ELISA法測定肺部TNF-α、IL-6的含量。
　　 9、采用AB-PAS染色方法了解氣道杯狀細(xì)胞增生情況。
　　 10、用免疫組化法測定氣道上皮Muc5ac的表達(dá)。
　　 11、采用熒光定量RT-PCR方法檢測氣道Muc5ac mRNA的表達(dá)。
　　 12、采用Western blot方法檢測肺部信號蛋白NF-κB的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、吸煙導(dǎo)致COPD大

9、鼠模型。
　　 吸煙12周大鼠出現(xiàn)明顯氣道炎癥和肺氣腫的病理改變:FEV0.3/FVC、PEF顯著降低。
　　 2、掃描電鏡觀察到COPD組大鼠氣道上皮破壞,纖毛細(xì)胞數(shù)量顯著減少,有的上皮完全脫落。
　　 3、99mTc-SC氣溶膠顯像測定氣道MCC功能,結(jié)果顯示COPD組的氣道粘液纖毛清除率較對照組明顯下降(P＜0.05)。
　　 4、與對照組相比,COPD大鼠銅綠假單胞菌清除減低(P＜0.05),標(biāo)準(zhǔn)

10、桃金娘油組大鼠肺組織勻漿及支氣管肺泡灌洗液中活菌計(jì)數(shù)明顯降低(P＜0.05)。
　　 5、COPD大鼠肺內(nèi)細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞以及前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)增加,標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油減少吸煙引起的炎癥細(xì)胞及炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放。
　　 6、AB-PAS染色結(jié)果示COPD組大鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞明顯增加,標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油能抑制吸煙引起的杯狀細(xì)胞增生(P＜0.05)。
　　 7、熒光定量RT-PCR和免

11、疫組化檢測結(jié)果顯示吸煙從基因和蛋白水平增加粘蛋白Muc5ac表達(dá),標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油明顯抑制吸煙引起氣道粘蛋白Muc5ac的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 8、銅綠假單胞菌感染引起Muc5ac粘蛋白表達(dá)增加在24h時(shí)達(dá)高峰,72h后有所降低。
　　 9、COPD大鼠模型中肺組織NF-κB水平明顯增高,標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油抑制吸煙導(dǎo)致的NF-κB表達(dá)增加。
　　 10、標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組大鼠肺部細(xì)菌計(jì)數(shù)減少與粘蛋白Muc5ac、NF-

12、κB的表達(dá)下降及炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放減少呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 COPD大鼠較對照組大鼠對銅綠假單胞菌的清除能力明顯減低,這種清除缺陷同時(shí)伴有氣道上皮MCC減低。COPD大鼠細(xì)菌定植放大和延長免疫炎癥反應(yīng),同時(shí)促進(jìn)粘蛋白表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油促進(jìn)銅綠假單胞菌從肺內(nèi)清除。它能抑制吸煙導(dǎo)致的粘蛋白Muc5ac高分泌;同時(shí)亦能抑制由吸煙引起的炎癥因子釋放及NF-κB表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油增加細(xì)菌清除與它能抑制氣道