癌基因Gfi-1在急性髓系白血病中的表達及意義.pdf

1、第一部分 目的：了解急性髓系白血病細胞中Gfi-1基因的表達情況及其與臨床的關系。
　　 方法：1.5 株白血病/淋巴瘤細胞系，AML患者92例。初診AML73例，完全緩解19例。采用RT-PCR和Western-blot方法，分別檢測了以上5 株白血病/淋巴瘤細胞系和AML 骨髓單個核細胞中Gfi-1的表達。并以10例非腫瘤性血液病患者和5例健康供者骨髓作為正常對照。
　　 2.我們對92例急性髓系白血病中Gfi-1基

2、因陽性表達率與患者的一些臨床指標進行相關性分析，我們根據(jù)外周血白細胞計數(shù)將白血病患者分為2組：①腫瘤低負荷組:外周血WBC＜20×109 /L；②腫瘤高負荷組:具備外周血WBC≥20×109 /L。
　　 3.用激光共聚焦顯微鏡觀察Gfi-1蛋白在骨髓MNC的表達和分布。
　　 結果：1.通過RT-PCR 發(fā)現(xiàn)在所檢測的5 株白血病/淋巴瘤細胞系中，細胞系Gfi-1mRNA 均呈陽性表達,但程度不一。HL-60，K562

3、和Jurkat 細胞Gfi-1基因呈明顯的強陽性表達，在U937，Molt-4 中呈現(xiàn)中等強度的表達，對92例急性髓系白血病病患者和15例對照人骨髓中Gfi-1基因mRNA的表達檢測結果顯示，Gfi-1 mRNA在初治急性髓系白血病中的表達比對照骨髓明顯增高。對初治病例73例AML 患者按照FAB分型后，Gfi-1在M1 17例、M2 30例、M3 16例、M4 4例、M5 21例、M6 4例例中的表達明顯較對照組增高，但是在各型中的表

4、達無差異。初治病例表達明顯較完全緩解病例19例高，而AML-CR 比對照組增高，但表達無統(tǒng)計學差異。
　　 2.我們對92例急性髓系白血病中Gfi-1基因陽性表達率與患者的一些臨床指標(患者的年齡，性別，肝脾有無腫大，外周血白細胞記數(shù))進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)Gfi-1的表達與患者的年齡，性別及肝脾腫大等無明顯相關性，而與外周血白細胞計數(shù)有關。其中，外周血白細胞計數(shù)≥20×109 /L的白血病患者骨髓單個核細胞Gfi-1mRNA 陽

5、性表達率為100[％]；外周血白細胞計數(shù)＜20×109 /L為75.86[％]，兩者相比有統(tǒng)計學意義。正常對照者和外周血白細胞計數(shù)＜20×109 /L患者的表達差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.Gfi-1蛋白在急性髓系白血病的表達我們對急性髓系白血病中Gfi-1蛋白表達情況進行了Western-blot分析，對AML 患者和對照人骨髓中Gfi-1蛋白的表達檢測結果顯示，Gfi-1蛋白在初治AML 中的表達比對照骨髓明顯增高；初治病例

6、表達明顯較完全緩解病例19例高，而AML-CR 比對照組增高，但表達無統(tǒng)計學差異。
　　 4.Confocal 觀察Gfi-1在細胞中的的定位首先研究細胞系中Gfi-1 定位情況。通過Confocal 發(fā)現(xiàn)在所檢測的5 株細胞系細胞核中都有Gfi-1 表達，但程度不一。在HL-60，K562和Jurkat 細胞中，能夠檢測到細胞核和胞漿都有Gfi-1的強陽性表達；
　　 在U937，Molt-4 細胞中，細胞核和胞漿有中

7、等強度的Gfi-1 表達。對于13例AML和5例正常供者的骨髓單個核細胞Confocal分析表明，Gfi-1 主要位于細胞核中，尤其位于急性髓系白血病患者原始細胞細胞核中，大多數(shù)AML 患者細胞核中Gfi-1 出現(xiàn)較強的表達以及少量的細胞漿內表達。在正常骨髓和其他血液病骨髓單個核細胞中細胞核內沒有或者僅少量可以檢測到Gfi-1的表達。
　　 結論：急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表達,該表達在腫瘤負荷

8、高的急性髓系白血病患者顯著增高。分析Gfi-1表達與臨床指標相關性發(fā)現(xiàn)這種高表達與外周血高白細胞計數(shù)呈顯著的正相關性，而與患者的年齡，性別及肝脾腫大等無明顯相關性。提示Gfi-1可能是急性髓系白血病細胞生長的癌基因。而且在急性髓系白血病的發(fā)病中，Gfi-1基因可能是作為一個獨立的影響因索來發(fā)揮作用的。
　　 第二部分目的：了解急性髓系白血病細胞中Gfi-1基因在造血組細胞中的表達情況。
　　 方法：采用流式細胞分選AM

9、L16例初診(M1 7例、M2 6例、M3 3例)，完全緩解(AML-CR)3例和3例健康供者骨髓(正常對照)的CD34+細胞。采用RT-PCR和Western-blot方法分別檢測了CD34+細胞中Gfi-1的mRNA和蛋白表達。
　　 結果：1.對16例急性髓系白血病患者和3例對照人骨髓CD34+細胞中Gfi-1基因的RT-PCR 表達檢測結果顯示，在AML組和AML-CR組Gfi-1 陽性(分別為1.42±0.13和0.5

10、8±0.04)均高于正常水平(0.14±0.02)(P<0.0 1和P<0.05)，AML組和AML-CR組相比，AML組Gfi-1 表達又高于AML-CR組(P<0.05)。AML 中各亞型：M1 7例(1.14±0.11)、M2 6例(1.32±0.14)、M3 3例(1.47±0.15)之間Gfi-1 表達情況的相比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 2.對16例AML患者和3例對照人骨髓CD34+細胞中Gfi-1蛋

11、白的表達用Western-blot檢測結果顯示，在AML組和AML-CR組Gfi-1 陽性(分別為1.26±0.14和0.65±0.04)，均高于正常水平(0.24±0.02)(P<0.0 1和P<0.05)，AML組和AML-CR組相比，AML組Gfi-1 表達又高于AML-CR組(P<0.05)。AML 中各亞型(M1，M2，M3)之間Gfi-1表達情況的相比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 結論：正常人CD34+細

12、胞中Gfi-1有表達，在急性髓系白血病患者骨髓MNC CD34+細胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表達，該表達在初治的急性髓系白血病患者顯著增高。由于AML是造血干(祖)細胞性疾病，Gfi-1可能在AML發(fā)病中起一定作用。
　　 第三部分目的：研究阿霉素對HL-60 細胞增殖和凋亡的影響，并觀察阿霉素處理后HL-60 細胞Gfi-1 及相關凋亡基因的表達變化的影響，探討其抗白血病的分子機制。
　　 方法：用不同濃度(0.1

13、 mg/L,0.2 mg/L,0.5 mg/L,1.0 mg/L,2.0 mg/L，5.0mg/L)的阿霉素對處于對數(shù)生長期的HL-60細胞進行干預，未用阿霉素處理的HL-60細胞作為對照。
　　 24小時后，被干預細胞進行分析。采用MTT 法測定阿霉素對HL-60細胞增殖的影響。
　　 凋亡細胞細胞形態(tài)學檢測采用Hoechst33258 (8g/L)染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化；凋亡細胞用Annexin-V/P

14、I雙染后進行流式細胞分析計算實驗凋亡細胞百分率，及DNA電泳方法測定DNA 斷裂的片段分析。運用RT-PCR分析阿霉素處理后HL-60細胞Gfi-1及相關凋亡基因Bax和Bcl-2 mRNA變化。Western blot實驗分析HL-60細胞Gfi-1及相關凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白水平。
　　 結果：阿霉素抑制HL-60細胞生長呈量效關系；在不同濃度的阿霉素作用下HL-60細胞逐漸出現(xiàn)了細胞凋亡，隨著濃度的加大，在2.0

15、mg/L的阿霉素作用下HL-60細胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)改變，包括細胞胞體變小、胞膜皺折及卷曲、細胞質出現(xiàn)空泡、核固縮、染色質密聚集成塊并分布于核膜周邊等；而當阿霉素濃度達到5.0mg/L時，HL-60細胞出現(xiàn)死亡；流式細胞儀檢測出凋亡細胞百分率呈劑量依賴關系，在不同濃度的阿霉素作用下HL-60細胞凋亡率逐漸增大，在2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60細胞的凋亡率達到最大，為22.75±1.92[％]，而當阿霉素濃度達到5.0mg/

16、L時，HL-60細胞的大部分死亡，凋亡率下降為7.43±0.56[％]；2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60細胞基因組DNA電泳出現(xiàn)典型的“梯”狀條帶；RT-PCR分析0mg/L，0.5 mg/L和2.0mg/L阿霉素處理后HL-60細胞Gfi-1mRNA及相關凋亡基因Bax和Bcl-2mRNA變化發(fā)現(xiàn)，Gfi-1的條帶逐漸變得模糊,灰度掃描結果比值統(tǒng)計檢測P＜0.05，差異有顯著性,說明Gfi-1 mRNA表達在阿霉素濃度越大時表

17、達減少，Bax條帶變得清晰,灰度掃描結果比值統(tǒng)計檢測P＜0.01，差異有顯著性,表明Bax基因表達在阿霉素濃度增加時表達增加，與Gfi-1 mRNA表達呈負相關，Bcl-2 mRNA條帶變化在0mg/L，0.5 mg/L，2.0mg/L不明顯,灰度掃描結果比值統(tǒng)計檢測p﹥0.05，差異無顯著性，表明Bcl-2基因表達在阿霉素濃度在0mg/L，0.5 mg/L與2.0 mg/L濃度下變化不大。Western blot結果顯示HL-60細胞