癌基因Gfi-1在急性髓系白血病中的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分 目的：了解急性髓系白血病細(xì)胞中Gfi-1基因的表達(dá)情況及其與臨床的關(guān)系。
　　 方法：1.5 株白血病/淋巴瘤細(xì)胞系，AML患者92例。初診AML73例，完全緩解19例。采用RT-PCR和Western-blot方法，分別檢測(cè)了以上5 株白血病/淋巴瘤細(xì)胞系和AML 骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Gfi-1的表達(dá)。并以10例非腫瘤性血液病患者和5例健康供者骨髓作為正常對(duì)照。
　　 2.我們對(duì)92例急性髓系白血病中Gfi-1基

2、因陽(yáng)性表達(dá)率與患者的一些臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，我們根據(jù)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)將白血病患者分為2組：①腫瘤低負(fù)荷組:外周血WBC＜20×109 /L；②腫瘤高負(fù)荷組:具備外周血WBC≥20×109 /L。
　　 3.用激光共聚焦顯微鏡觀察Gfi-1蛋白在骨髓MNC的表達(dá)和分布。
　　 結(jié)果：1.通過(guò)RT-PCR 發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的5 株白血病/淋巴瘤細(xì)胞系中，細(xì)胞系Gfi-1mRNA 均呈陽(yáng)性表達(dá),但程度不一。HL-60，K562

3、和Jurkat 細(xì)胞Gfi-1基因呈明顯的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在U937，Molt-4 中呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的表達(dá)，對(duì)92例急性髓系白血病病患者和15例對(duì)照人骨髓中Gfi-1基因mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，Gfi-1 mRNA在初治急性髓系白血病中的表達(dá)比對(duì)照骨髓明顯增高。對(duì)初治病例73例AML 患者按照FAB分型后，Gfi-1在M1 17例、M2 30例、M3 16例、M4 4例、M5 21例、M6 4例例中的表達(dá)明顯較對(duì)照組增高，但是在各型中的表

4、達(dá)無(wú)差異。初治病例表達(dá)明顯較完全緩解病例19例高，而AML-CR 比對(duì)照組增高，但表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.我們對(duì)92例急性髓系白血病中Gfi-1基因陽(yáng)性表達(dá)率與患者的一些臨床指標(biāo)(患者的年齡，性別，肝脾有無(wú)腫大，外周血白細(xì)胞記數(shù))進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Gfi-1的表達(dá)與患者的年齡，性別及肝脾腫大等無(wú)明顯相關(guān)性，而與外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)。其中，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥20×109 /L的白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞Gfi-1mRNA 陽(yáng)

5、性表達(dá)率為100[％]；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜20×109 /L為75.86[％]，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照者和外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜20×109 /L患者的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.Gfi-1蛋白在急性髓系白血病的表達(dá)我們對(duì)急性髓系白血病中Gfi-1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了Western-blot分析，對(duì)AML 患者和對(duì)照人骨髓中Gfi-1蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，Gfi-1蛋白在初治AML 中的表達(dá)比對(duì)照骨髓明顯增高；初治病例

6、表達(dá)明顯較完全緩解病例19例高，而AML-CR 比對(duì)照組增高，但表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.Confocal 觀察Gfi-1在細(xì)胞中的的定位首先研究細(xì)胞系中Gfi-1 定位情況。通過(guò)Confocal 發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的5 株細(xì)胞系細(xì)胞核中都有Gfi-1 表達(dá)，但程度不一。在HL-60，K562和Jurkat 細(xì)胞中，能夠檢測(cè)到細(xì)胞核和胞漿都有Gfi-1的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；
　　 在U937，Molt-4 細(xì)胞中，細(xì)胞核和胞漿有中

7、等強(qiáng)度的Gfi-1 表達(dá)。對(duì)于13例AML和5例正常供者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞Confocal分析表明，Gfi-1 主要位于細(xì)胞核中，尤其位于急性髓系白血病患者原始細(xì)胞細(xì)胞核中，大多數(shù)AML 患者細(xì)胞核中Gfi-1 出現(xiàn)較強(qiáng)的表達(dá)以及少量的細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。在正常骨髓和其他血液病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有或者僅少量可以檢測(cè)到Gfi-1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表達(dá),該表達(dá)在腫瘤負(fù)荷

8、高的急性髓系白血病患者顯著增高。分析Gfi-1表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)這種高表達(dá)與外周血高白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著的正相關(guān)性，而與患者的年齡，性別及肝脾腫大等無(wú)明顯相關(guān)性。提示Gfi-1可能是急性髓系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的癌基因。而且在急性髓系白血病的發(fā)病中，Gfi-1基因可能是作為一個(gè)獨(dú)立的影響因索來(lái)發(fā)揮作用的。
　　 第二部分目的：了解急性髓系白血病細(xì)胞中Gfi-1基因在造血組細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 方法：采用流式細(xì)胞分選AM

9、L16例初診(M1 7例、M2 6例、M3 3例)，完全緩解(AML-CR)3例和3例健康供者骨髓(正常對(duì)照)的CD34+細(xì)胞。采用RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)了CD34+細(xì)胞中Gfi-1的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.對(duì)16例急性髓系白血病患者和3例對(duì)照人骨髓CD34+細(xì)胞中Gfi-1基因的RT-PCR 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，在AML組和AML-CR組Gfi-1 陽(yáng)性(分別為1.42±0.13和0.5

10、8±0.04)均高于正常水平(0.14±0.02)(P<0.0 1和P<0.05)，AML組和AML-CR組相比，AML組Gfi-1 表達(dá)又高于AML-CR組(P<0.05)。AML 中各亞型：M1 7例(1.14±0.11)、M2 6例(1.32±0.14)、M3 3例(1.47±0.15)之間Gfi-1 表達(dá)情況的相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2.對(duì)16例AML患者和3例對(duì)照人骨髓CD34+細(xì)胞中Gfi-1蛋

11、白的表達(dá)用Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在AML組和AML-CR組Gfi-1 陽(yáng)性(分別為1.26±0.14和0.65±0.04)，均高于正常水平(0.24±0.02)(P<0.0 1和P<0.05)，AML組和AML-CR組相比，AML組Gfi-1 表達(dá)又高于AML-CR組(P<0.05)。AML 中各亞型(M1，M2，M3)之間Gfi-1表達(dá)情況的相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：正常人CD34+細(xì)

12、胞中Gfi-1有表達(dá)，在急性髓系白血病患者骨髓MNC CD34+細(xì)胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表達(dá)，該表達(dá)在初治的急性髓系白血病患者顯著增高。由于AML是造血干(祖)細(xì)胞性疾病，Gfi-1可能在AML發(fā)病中起一定作用。
　　 第三部分目的：研究阿霉素對(duì)HL-60 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并觀察阿霉素處理后HL-60 細(xì)胞Gfi-1 及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)變化的影響，探討其抗白血病的分子機(jī)制。
　　 方法：用不同濃度(0.1

13、 mg/L,0.2 mg/L,0.5 mg/L,1.0 mg/L,2.0 mg/L，5.0mg/L)的阿霉素對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，未用阿霉素處理的HL-60細(xì)胞作為對(duì)照。
　　 24小時(shí)后，被干預(yù)細(xì)胞進(jìn)行分析。采用MTT 法測(cè)定阿霉素對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響。
　　 凋亡細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)采用Hoechst33258 (8g/L)染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；凋亡細(xì)胞用Annexin-V/P

14、I雙染后進(jìn)行流式細(xì)胞分析計(jì)算實(shí)驗(yàn)凋亡細(xì)胞百分率，及DNA電泳方法測(cè)定DNA 斷裂的片段分析。運(yùn)用RT-PCR分析阿霉素處理后HL-60細(xì)胞Gfi-1及相關(guān)凋亡基因Bax和Bcl-2 mRNA變化。Western blot實(shí)驗(yàn)分析HL-60細(xì)胞Gfi-1及相關(guān)凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白水平。
　　 結(jié)果：阿霉素抑制HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)呈量效關(guān)系；在不同濃度的阿霉素作用下HL-60細(xì)胞逐漸出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡，隨著濃度的加大，在2.0

15、mg/L的阿霉素作用下HL-60細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)改變，包括細(xì)胞胞體變小、胞膜皺折及卷曲、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、核固縮、染色質(zhì)密聚集成塊并分布于核膜周邊等；而當(dāng)阿霉素濃度達(dá)到5.0mg/L時(shí)，HL-60細(xì)胞出現(xiàn)死亡；流式細(xì)胞儀檢測(cè)出凋亡細(xì)胞百分率呈劑量依賴關(guān)系，在不同濃度的阿霉素作用下HL-60細(xì)胞凋亡率逐漸增大，在2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60細(xì)胞的凋亡率達(dá)到最大，為22.75±1.92[％]，而當(dāng)阿霉素濃度達(dá)到5.0mg/

16、L時(shí)，HL-60細(xì)胞的大部分死亡，凋亡率下降為7.43±0.56[％]；2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60細(xì)胞基因組DNA電泳出現(xiàn)典型的“梯”狀條帶；RT-PCR分析0mg/L，0.5 mg/L和2.0mg/L阿霉素處理后HL-60細(xì)胞Gfi-1mRNA及相關(guān)凋亡基因Bax和Bcl-2mRNA變化發(fā)現(xiàn)，Gfi-1的條帶逐漸變得模糊,灰度掃描結(jié)果比值統(tǒng)計(jì)檢測(cè)P＜0.05，差異有顯著性,說(shuō)明Gfi-1 mRNA表達(dá)在阿霉素濃度越大時(shí)表

17、達(dá)減少，Bax條帶變得清晰,灰度掃描結(jié)果比值統(tǒng)計(jì)檢測(cè)P＜0.01，差異有顯著性,表明Bax基因表達(dá)在阿霉素濃度增加時(shí)表達(dá)增加，與Gfi-1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2 mRNA條帶變化在0mg/L，0.5 mg/L，2.0mg/L不明顯,灰度掃描結(jié)果比值統(tǒng)計(jì)檢測(cè)p﹥0.05，差異無(wú)顯著性，表明Bcl-2基因表達(dá)在阿霉素濃度在0mg/L，0.5 mg/L與2.0 mg/L濃度下變化不大。Western blot結(jié)果顯示HL-60細(xì)胞