實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NF-kB在急性髓系白血病中的表達(dá).pdf

1、背景與目的
　　 核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(Nuclear factor-kappa B，NF-κ B)是一種幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞的蛋白復(fù)合體[1]。Sen等1986年首次在成熟B細(xì)胞，漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的能與免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子B點(diǎn)特異結(jié)合的核蛋白，并能促進(jìn)κ基因表達(dá)的核蛋白因子。NF-κ B幾乎存在于所有的細(xì)胞中。NF-κ B家族包括NF-κ B1(P50)，NF-κ B2(P52)，RelA(p65)，RelB和c-Rel等，其共同點(diǎn)

2、是擁有一個(gè)有300個(gè)氨基酸組成的高度保守的Rel同源結(jié)構(gòu)域，該區(qū)為與DNA結(jié)合、二聚體化、Iκ B相互作用及核定位信號(hào)區(qū)域。
　　 在胞漿中NF-κ B與一種抑制性蛋白Iκ B結(jié)合處于失活狀態(tài)，能被激活劑如TNF，生長(zhǎng)因子，氧化劑，病毒，藥物等激活。被激活的κB與NF-κ B抑制蛋白(Iκ B)解離，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的κB序列結(jié)合，增強(qiáng)其表達(dá)。NF-κ B是一類功能廣泛的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控，參與機(jī)體的免疫，炎癥，

3、腫瘤的發(fā)生，細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[2，3]。
　　 研究顯示NF-κ B導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生是因?yàn)榧?xì)胞因子或其受體基因轉(zhuǎn)錄的激活，促進(jìn)了非調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)或阻斷凋亡。此外，NF-κ B直接作用于細(xì)胞周期或DNA復(fù)制也會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[4]。體外實(shí)驗(yàn)表明，抑制NFκB能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在急性髓系白血病(AML)患者存在持續(xù)活化或高活性的NF-κ B，且AML患者NF-κ B活性與其亞型

4、有關(guān)[6，7]。應(yīng)用定量PCR方法檢測(cè)AML患者NF-κ B mRNA表達(dá)情況，國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法比較正常人及AML患者NF-κ B mRNA表達(dá)水平差異，探索其在AML發(fā)病中可能的作用機(jī)制。
　　 對(duì)象與方法
　　 1研究對(duì)象：60例病例來(lái)自2008年9月-2010年3月我院住院或門診初診急性髓系白血病患者，男性28例，女性32例，平均年齡38(16-76)歲，其中M13例，M222例，M31

5、8例，M47例，M510例，正常對(duì)照為6名骨髓移植供者。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄：Trizol一步法提取總RNA，檢測(cè)其完整性和濃度，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，反應(yīng)液配制按試劑盒要求操作，反應(yīng)條件：42℃60min，70℃5min，4℃5min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.2一致性檢測(cè)

6、： PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液12.5μ1，cDNA模板3ul，上下游引物各0.25u l，滅菌超純水9u1，PCR反應(yīng)總體積為25μl，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，57℃退火45 sec，72℃延伸1 min的條件下循環(huán)35次，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(90V，30min)。
　　 2.3實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增在ABI3700實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。TAKAR

7、A設(shè)計(jì)合成NF-κ B基因引物。上游引物序列為5'CTG AAC CAG GGC ATACCT GT3'，下游引物序列為5'GAG AAG TCC ATG TCC GCA AT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物197bp，內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5'TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3'，下游引物序列為5' TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3'，擴(kuò)增產(chǎn)物206bp。PCR反應(yīng)液購(gòu)買于TAKARA公司的SYBR Prime

8、ScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime)，反應(yīng)體系為50μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min;第二階段：94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸45sec;40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，間隔30s繪制溶解曲線。結(jié)果
　　 1.瓊脂糖凝膠電泳圖(見附頁(yè))可見各組NF-κ B cDNA及內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增結(jié)果，內(nèi)參擴(kuò)增條帶位于206bp左右，NF-κ B擴(kuò)增條帶位于197bp左

9、右。
　　 2.NF-κ B的Real-time PCR結(jié)果：將相當(dāng)于0.01～100ng總RNA的cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。由圖可知(見附頁(yè))，NF-κ B，GAPDH擴(kuò)增曲線中溶解溫度90℃和87℃左右，說(shuō)明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一產(chǎn)物。NF-κ B及GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線及兩者的擴(kuò)增效率(Ef)基本一致。
　　 3.NF-κ B mRNA在急性髓系白血病不同亞型中的表達(dá)對(duì)目的基因和參比

10、基因的CT值進(jìn)行歸一化，即△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參，各組NF-κ BmRNA表達(dá)量以(?)±s表示，由表可見實(shí)驗(yàn)組NF-κ B mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，應(yīng)用方差分析，M4組NF-κ BmRNA表達(dá)量大于M2組(P＜0.05)，M5組大于M1，M2，M3組(P＜0.05)，余差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論
　　 1.NF-κ B在AML中表達(dá)升高，其表達(dá)上調(diào)在AML發(fā)病中可能起了重要作用。
　　 2.NF-κ