皮膚毛囊神經(jīng)嵴干細胞的黑素定向分化和衰老機制研究.pdf

1、研究背景：白癜風(fēng)是表皮黑素細胞(MC)毀損導(dǎo)致的獲得性色素脫失性皮膚病。雖然該病并不影響個體生存，但可嚴(yán)重?fù)p害容貌外觀，妨礙工作、學(xué)習(xí)、婚戀等社交活動，導(dǎo)致沉重的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，甚至發(fā)展成為心身性疾病，威脅家庭和睦及和諧社會的構(gòu)建。但棘手的是，由于其病因復(fù)雜、確切機制尚不明了，目前沿用的治療方法效果尚不完全令人滿意。因此，進一步闡明白癜風(fēng)的發(fā)病機理對于尋找新的治療靶點有著至關(guān)重要的意義，其中從干細胞生物學(xué)的角度出發(fā)，探索皮膚干細胞→MC

2、分化和增殖的調(diào)控機制將會是個有益的嘗試。
　　 研究對象：皮膚干細胞是真、表皮及附屬器中處于未分化的原始階段、能進行自我更新、同時也可分化成特定組織類型的“種子細胞”。其中，神經(jīng)嵴干細胞(NCSC)是源自胚胎神經(jīng)板的多能干細胞，其遷移并定居在毛囊隆突、毛乳頭和真皮，形成了皮膚黑素細胞、感覺神經(jīng)元和施萬細胞、真皮間質(zhì)細胞等成分。因其強大的遷移分化和再生修復(fù)能力，NCSC是維持皮膚微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要力量，更是色素形成、毛發(fā)生長、創(chuàng)傷愈

3、合等生理/病理功能的細胞學(xué)基礎(chǔ)。因此說，對于皮膚病特別是色素疾病的基礎(chǔ)研究，NCSC是個提綱挈領(lǐng)的切入點；對指導(dǎo)臨床實踐和開發(fā)新療法，這也極具運用前景。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、毛囊NCSC的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 干細胞龕是成體干細胞在體內(nèi)集中存儲的部位，它是由特定的基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的特殊微環(huán)境，毛囊隆突是皮膚NCSC最主要的龕之一。 本課題以小鼠觸須為研究模型，采用顯微外科方法分離隆突，探索并優(yōu)

4、化NCSC的培養(yǎng)方法。這些隆突來源干細胞具有很強的自我更新/增殖能力，能在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮的克隆性生長，形成三維球體結(jié)構(gòu)Bulge sphere。免疫熒光染色和RT-PCR顯示，它們表達多種NCSC標(biāo)志物如p75、Sox10、Nestin等和胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子如Sox2、Klf4、cMyc等，進一步說明其是由未分化的幼稚細胞構(gòu)成。在相應(yīng)藥物誘導(dǎo)下，隆突細胞可以定向分化成脂肪細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)元、施萬細胞、骨和軟骨等多種細胞類型，

5、可見其很高的多向分化潛能。 結(jié)論：皮膚NCSC來源豐富不受限，位置表淺易取材，多向分化運用廣，倫理道德爭議小，是比骨髓、臍血等更理想的干細胞來源。我們建立了從毛囊顯微分離、NCSC培養(yǎng)到干細胞表型鑒定、多向分化誘導(dǎo)的一整套技術(shù)方法，為皮膚病基礎(chǔ)研究和臨床自體移植提供一種全新的干細胞來源。
　　 二、毛囊NCSC的黑素定向分化
　　 白癜風(fēng)恢復(fù)期常見以毛囊為中心的點狀色素沉著，同時病理顯示有無色素的未成熟MC從毛囊向表皮遷

6、出；而少毛/無毛部位，復(fù)色困難；進一步地，而且移植正常毛囊至白斑部位可以治療白癜風(fēng)：這都提示毛囊在成體皮膚色素系統(tǒng)的修復(fù)中起著重要作用。 我們以毛囊NCSC為種子細胞，經(jīng)過2-3周的MC方向誘導(dǎo)，分化細胞呈現(xiàn)類似正常MC的多極樹突或雙極樹突外觀，并表達MC特異標(biāo)志物MITF和TYR。更重要的是，分化細胞呈多巴反應(yīng)陽性，能將無色的L-DOPA轉(zhuǎn)化成棕色色素顆粒，這就從功能上證實其具有合成黑色素的初步能力。 效率低下一直是困擾MC體外分化的

7、難題。為此，我們反復(fù)比較了各種誘導(dǎo)劑的效果，最后選定了一個含有ET-3、SCF、Wnt3a和TPA等多種成分的“雞尾酒”式的復(fù)合配方，使得分化效率大幅上調(diào)，可達將近40％。 為研究NCSC→MC分化的調(diào)控機制，我們以Realtime PCR動態(tài)監(jiān)測若干重要分子在分化過程中的時相變化，發(fā)現(xiàn)在干細胞“命運決定”過程中屬于“早期”事件、處于信號通路上游的MITF和TRP-2在誘導(dǎo)后很快激活表達，且表達幅度也很高；而處于級聯(lián)反應(yīng)的下游的TYR和

8、Pmel17則較晚表達。 結(jié)論：皮膚NCSC是表皮和毛發(fā)MC的來源，NCSC→MC的分化調(diào)控是色素疾病發(fā)病和臨床干預(yù)的潛在靶點。我們從干細胞技術(shù)出發(fā)，建立了從NCSC→MC的高效分化方法，并初步研究了調(diào)控分化進程的分子機制。該內(nèi)容為探索色素性皮膚病的成因和尋找新靶點奠定實驗基礎(chǔ)，也為臨床MC自體移植提供一種便捷的細胞來源。
　　 三、毛囊NCSC的衰老
　　 衰老是隨著年齡增長而發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)和生理功能的慢性損傷，每個個

9、體均無法避免、逆轉(zhuǎn)、或者中止。盡管抗衰老研究由來已久，但從干細胞生物學(xué)的角度切入?yún)s是個嶄新的研究領(lǐng)域。 我們以不同年齡小鼠來源的毛囊NCSC為模型，研究衰老對干細胞干性即自我更新和多向分化能力，以及遷移等重要功能的影響。結(jié)果顯示隨著年齡增長，毛囊NCSC增殖能力下降，形成神經(jīng)球的數(shù)目減少、體積縮小，倍增時間明顯延長；分化潛能亦顯著衰退，成脂、成黑素分化出現(xiàn)障礙。老年NCSC還表現(xiàn)出較差的遷移能力，其驅(qū)動遷移的關(guān)鍵基因Slug表達下調(diào)，而

10、與細胞粘附/錨定相關(guān)的基因N-CAM、N-Cadherin表達上調(diào)。在細胞衰老機制上，我們發(fā)現(xiàn)老年NCSC有較多的SA-β-gal+衰老細胞、較少的BrdU+增殖細胞、較多的G0/G1期靜止細胞和較低的端粒酶活性。
　　 結(jié)論：皮膚衰老的本質(zhì)是皮膚干細胞及其干細胞龕的衰老。本課題著重研究了衰老對毛囊NCSC干性的影響，并對其機制做了初步探索，這為解釋皮膚衰老的病理機制和探索抗衰老的靶點提供了實驗基礎(chǔ)，也為替代治療如何選擇供體年齡