人尿液源性干細胞誘導多潛能干細胞來源的神經(jīng)嵴細胞模型的建立.pdf

1、目的：探究用于誘導尿液來源的誘導多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells from urine，UiPSCs）的尿液細胞是否為尿液源性干細胞（urine-derived stem cells, USCs），以及在無飼養(yǎng)層、無病毒的條件下通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染非整合附著體質(zhì)粒載體將USCs重編程為誘導多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并由此分化為神經(jīng)嵴細胞的可

2、能，從而建立人尿液源性干細胞—誘導多潛能干細胞來源的神經(jīng)嵴細胞模型。
　　方法：按照UiPS技術(shù)中提取尿液細胞的方法，即用LONZA腎上皮細胞生長培養(yǎng)基提取并培養(yǎng)人的尿液細胞。擴增后進行多能性鑒定：流式細胞術(shù)鑒定USCs常見標志物（CD34、CD45、CD29、CD73、CD146）的表達，以及分化為脂肪細胞、骨以及平滑肌細胞的能力。通過NucleofectorR Ⅱ細胞核轉(zhuǎn)染儀將質(zhì)粒pCXLE-EGF導入尿液細胞，觀察電轉(zhuǎn)后第1

3、周至第4周綠色熒光表達量的變化。同樣的方法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-EGFP、pCXLE-hSK以及pCXLE–hΜL，將尿液細胞在無飼養(yǎng)層以及無病毒的條件下重編程為iPSCs，并進行iPSCs多能性鑒定。最后，將iPSCs向神經(jīng)嵴方向分化并通過定量PCR對神經(jīng)嵴標志物（AP2、p75、HNK1、FoxD3）進行鑒定。
　　結(jié)果：流式細胞術(shù)檢測LONZA腎上皮細胞生長培養(yǎng)基提取并培養(yǎng)出的尿液細

4、胞USCs標志物的表達，結(jié)果顯示陽性標志物CD29、CD73、CD146均為陽性，其中CD29、CD73的表達率均>95％，陰性標志物CD34、CD45均為陰性，表達率均<3%，符合尿液源性干細胞的標準。成脂誘導分化結(jié)束后通過油紅 O染色可見細胞內(nèi)含有大量紅染的脂滴。成骨誘導分化結(jié)束后，普通光學顯微鏡下即可見鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色后呈紅色。成平滑肌細胞誘導分化結(jié)束后，定量PCR比較誘導前后平滑肌細胞特異性標志物（SM-22α、SMMHC、

5、SM-α-actin和calopnin）表達量的變化，結(jié)果證實SM-22α、SM-α-actin和calopnin的表達量較誘導前顯著提高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染pCXLE-EGFP一天后即可觀察到熒光表達，且熒光的表達量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸減低。在無飼養(yǎng)層的條件下，本實驗從4.8×105細胞中獲得37個克隆，重編程效率約為0.008%（出現(xiàn)的克隆數(shù)量/電轉(zhuǎn)的細胞數(shù)）。多能性鑒定顯示：堿性磷酸酶染色、免疫熒光（O

6、CT4、SOX2、NANOG、SSEA4）、流式細胞術(shù)（SSEA4、TRA-1-60）鑒定均為陽性。擬胚體實驗可見消化后懸浮培養(yǎng)的iPS細胞團自行聚集成球形，且隨著時間的增長，擬胚體球的體積越來越大，顏色越來越深，貼壁培養(yǎng)后可見有不同形態(tài)的細胞爬出。定量PCR鑒定各胚層標志物基因表達量的變化，結(jié)果顯示與未分化的人iPSCs相比，SOX17（內(nèi)胚層標志物）、MSX1（中胚層標志物）以及 MAP2（外胚層標志物）的表達量均有顯著地提高（P<

7、0.05）。畸胎瘤實驗證實此細胞具有在體內(nèi)環(huán)境下分化為三個胚層不同細胞的能力，如腺體（內(nèi)胚層）、肌肉(中胚層)、神經(jīng)管（外胚層）。向神經(jīng)嵴方向誘導分化后可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生變化，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)多改變?yōu)槿切位蛘叨嘟切?，有多個細而長的突起，并相互連接形成網(wǎng)狀。以未分化的人iPSCs為對照組，定量PCR鑒定神經(jīng)嵴細胞特異性標志物（AP2、p75、HNK1、FoxD3）表達量的變化，結(jié)果顯示誘導后特異性標志物的表達較未分化的iP

8、SCs有顯著地提高（P<0.05），并且標志物的表達隨著誘導時間的延長而提高（P<0.05）。
　　結(jié)論：采用LONZA腎上皮細胞生長培養(yǎng)基提取的尿液細胞，不僅表達USCs常見的表面標志物，而且具有與USCs相似的體外分化能力，也就是說這種尿液細胞即為USCs。在無飼養(yǎng)層、無病毒的條件下，利用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染USCs可以獲得人的iPSCs，而且經(jīng)過小分子誘導可以分化為神經(jīng)嵴細胞，從而成功建立USCs來源的iPSCs分化而成的神經(jīng)嵴細胞模型