神經(jīng)嵴來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞在牙向分化中的潛能及相關(guān)機制的研究.pdf

1、長期以來，因齲病、牙周病、創(chuàng)傷等原因造成的牙齒缺失對人類造成較大的困擾，包括種植牙在內(nèi)的各種缺失牙修復(fù)方法各有其局限，尚不能完全恢復(fù)缺牙患者的生理和心理功能。牙組織工程和牙再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)提供了一條更為適宜的思路，即重新啟動牙齒發(fā)育進程，以修復(fù)牙體、牙周組織缺損，直至全牙再生。在牙組織工程中，適宜種子細(xì)胞的選擇是組織工程三要素中最為重要的內(nèi)容。神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(ectomesenchymal stem cells，EMSCs)

2、和外胚層來源的上皮細(xì)胞的連續(xù)相互作用貫穿于牙形態(tài)發(fā)生的始終。在經(jīng)典的牙發(fā)育理論中，牙齒的發(fā)生是由這兩個胚層細(xì)胞經(jīng)復(fù)雜的上皮-間充質(zhì)相互作用，并伴隨著按嚴(yán)格時-空順序表達的信號分子“瀑布”調(diào)控完成的。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)嵴細(xì)胞從中、后腦的神經(jīng)嵴經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、脫層后遷移至第一腮弓，并組成第一腮弓的大部分組織，此時稱為外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。牙板形成后，牙齒發(fā)育開始啟動，牙板上皮來源的信號分子傳遞至其下方神經(jīng)嵴來源的EMSCs，引起其增殖、凝

3、聚，經(jīng)牙板期、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等明確的牙齒發(fā)育階段，在釉質(zhì)形成后，牙根發(fā)育啟動并最終萌出至咬合平面，完成牙齒的發(fā)育。在這一過程中，神經(jīng)嵴來源的EMSCs形成了除牙冠釉質(zhì)外全部牙體組織結(jié)構(gòu)，包括其派生的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞，其最終分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并分泌基質(zhì)，形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體、以及其派生的牙囊祖細(xì)胞(dental follicle progenitor cells，DFPCs)最終形成的牙骨質(zhì)、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可見，

4、牙齒發(fā)育早期的EMSCs具有雙向分化特性，即向成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙囊祖細(xì)胞及其子代細(xì)胞分化的特性，理論上EMSCs作為牙組織工程的種子細(xì)胞，具有形成除釉質(zhì)外牙齒全部結(jié)構(gòu)的能力。但這一胚胎發(fā)育過渡性的干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)環(huán)境下，是否具有牙向分化能力，尚待進一步明確。再者，目前牙發(fā)育相關(guān)研究表明，尚有非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)參與牙形態(tài)發(fā)生，牙組織工程相關(guān)研究也提示，除了神經(jīng)嵴來源的牙齒間充質(zhì)干細(xì)胞，非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等也可表

5、達牙向分化能力。神經(jīng)嵴源性和非神經(jīng)嵴源性的間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙組織工程的種子細(xì)胞，哪一個更為適宜，尚無明確定論。因此，目前有三個亟待解決的問題:①神經(jīng)嵴來源的EMSCs在體外牙向誘導(dǎo)環(huán)境下是否具有牙向分化能力？②神經(jīng)嵴來源的EMSCs作為種子細(xì)胞，和非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞比較，其成牙潛能如何？③牙胚的發(fā)生是通過口腔上皮與顱頜神經(jīng)嵴來源EMSCs細(xì)胞間的信號分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、進而推動的復(fù)雜發(fā)育過程，而胚胎發(fā)育早期EMSCs參與牙齒發(fā)育的內(nèi)在

6、分子調(diào)控機制尚待進一步明確。因此，研究牙發(fā)育早期EMSCs的成牙潛能和內(nèi)在分子機制，可以為完善牙發(fā)育學(xué)理論，以及為牙組織工程的種子細(xì)胞選擇和構(gòu)建組織工程牙胚，提供初步的依據(jù)和策略。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果
　　目的:
　　本課題主要對比研究大鼠胚胎11.5d(E11.5d)第一腮弓神經(jīng)嵴來源的EMSCs和非神經(jīng)嵴來源的EMSCs，在體外、體內(nèi)成牙誘導(dǎo)微環(huán)境下的成牙潛能差異;利用細(xì)胞凝聚技術(shù)還原牙齒器官發(fā)育模式，從上皮-

7、間充質(zhì)相互作用和牙發(fā)育角度探討明確的神經(jīng)嵴來源的EMSCs在體外、體內(nèi)的牙向分化模式;進一步以基因芯片技術(shù)探討神經(jīng)嵴來源的EMSCs在牙向分化過程中可能存在的分子機制，為牙發(fā)育機制和牙組織工程再生提供可能的理論依據(jù)和策略。
　　方法:
　　1.為明確P75-NTR標(biāo)記的EMSCs在牙發(fā)育中的時空變化，我們通過對E11.5-E18.5d大鼠胚胎牙齒不同發(fā)育階段的連續(xù)觀察，利用HE和IHC技術(shù)對比觀察神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)記物，P75神

8、經(jīng)營養(yǎng)因子受體(P75-neurotrophin receptor，P75-NTR)以及胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物OCT4和SOX2，在牙發(fā)育各個時期EMSCs中的時空表達和生物學(xué)功能;
　　2.為獲取明確的神經(jīng)嵴來源的EMSCs，我們以流式細(xì)胞技術(shù)分選E11.5d大鼠胚胎第一腮弓來源的P75-NTR陽性EMSCs(P75+EMSCs)，原代細(xì)胞培養(yǎng)后進行增殖能力檢測和干細(xì)胞鑒定;
　　3.為明確P75+EMSCs是否具有牙向分化能力

9、，及探討與非神經(jīng)嵴來源的P75-NTR陰性EMSCs(P75-EMSCs)的牙向分化能力差異，我們利用大鼠切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞系HAT-7條件培養(yǎng)液和切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞，通過體外、體內(nèi)誘導(dǎo)模式對P75+EMSCs進行牙向分化誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)模式下以HAT-7條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)0、4、8、12d后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，透射電鏡(TEM)檢測誘導(dǎo)前后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化;對比P75-EMSCs，Western blot和Rea

10、l-time PCR檢測成牙關(guān)鍵基因和蛋白DSP、DMP1等變化;體內(nèi)誘導(dǎo)模式下，以原代大鼠切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞重組P75+EMSCs/P75-EMSCs（細(xì)胞比例2∶3），以Ⅰ型膠原蛋白為重組體支架，待細(xì)胞自發(fā)凝聚后，大鼠腎被膜下移植，4周后取材進行IHC鑒定成牙關(guān)鍵蛋白DSP和DMP1表達;
　　4.為進一步探討神經(jīng)嵴和非神經(jīng)嵴來源的EMSCs牙向分化差異的分子機制，我們以基因芯片微陣列分析E11.5d P75+EMSCs和P7

11、5-EMSCs基因表達譜差異基因，KEGG代謝通路分析牙發(fā)育相關(guān)信號通路。然后以siRNA-Smad4沉默P75+EMSCs的TGF-β信號通路關(guān)鍵蛋白Smad4，Smad4激活劑kartogenin激活P75-EMSCs的Smad4表達，以上兩組細(xì)胞在HAT-7條件培養(yǎng)液牙向分化誘導(dǎo)后，以Western blot檢測TGF-β信號通路關(guān)鍵蛋白Smad4對P75+EMSCs和P75-EMSCs牙向分化能力的影響。
　　結(jié)果:

12、>　　1.P75-NTR作為公認(rèn)的神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)記物，在牙齒各個發(fā)育時期的牙源性間充質(zhì)中都連續(xù)表達，可以作為神經(jīng)嵴來源的EMSCs的連續(xù)標(biāo)記物。其同時在牙上皮表達，顯示其參與了上皮和間充質(zhì)的相互作用;胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物OCT4和SOX2的表達在牙發(fā)育早期表達較弱，在牙發(fā)育后期（鐘狀期）的上皮-間充質(zhì)界面強烈表達，顯示其協(xié)同P75-NTR調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用;
　　2.分選前EMSCs形態(tài)具有高度異質(zhì)性，顯示不同族群的細(xì)胞雜居生

13、長。分選后的P75+EMSCs呈短梭三角形，形態(tài)趨于一致。P75+EMSCs分選比率為24.5％提示其在第一腮弓組織中有較高的比率。細(xì)胞增殖實驗顯示P75+EMSCs的增殖能力顯著高于P75EMSCs。免疫熒光鑒定P75+EMSCs具備間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原(Stro-1、vimintin)和神經(jīng)嵴細(xì)胞（P75-NTR，Ap2α，HNK-1）雙重標(biāo)記物，同時胚胎源性標(biāo)記物OCT4陽性，提示為具有神經(jīng)嵴源性和間充質(zhì)干細(xì)胞雙重特性的外胚間充質(zhì)

14、干細(xì)胞(EMSCs);
　　3.P75+EMSCs在體外成牙誘導(dǎo)模式下細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化以及高表達成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Dspp(DSP)和Dmp1，證實細(xì)胞分化為具有分泌功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。P75+EMSCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Dspp和Dmp1的mRNA顯著高于P75-EMSCs。體內(nèi)在牙源性上皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)下，P75+EMSCs呈一定層次圍繞島型牙源性上皮，強烈表達DSP和DMP1，而P75-E

15、MSCs細(xì)胞未見表達。體外、體內(nèi)兩種成牙誘導(dǎo)模式下證實，P75+EMSCs的牙向分化能力顯著高于P75-EMSCs;
　　4.對比P75-EMSCs，P75+EMSCs有128個基因上調(diào)，15個基因下調(diào)(fold change≥1.5)，KEGG代謝通路分析顯示涉及多個信號通路，其中TGF-β信號通路與牙齒發(fā)育密切相關(guān)。在差異基因中，Smad4是TGF-β信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點。Western blot和Real-time PCR的

16、結(jié)果也證實P75+EMSCs的Smad4表達水平顯著高于P75-EMSCs。P75+EMSCs經(jīng)特異性的siRNA-Smad4沉默后，其成牙能力相應(yīng)受到抑制，而P75-EMSCs經(jīng)smad4激活劑激活后，其成牙能力顯著增加。這一結(jié)果表明，P75+EMSCs較P75-EMSCs具有更為活躍的成牙分化潛能的機制，可能在于其通過smad4介導(dǎo)的TGF-β信號通路實現(xiàn)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，E11.5d大鼠胚胎腮弓來源的P75