小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)高度相似的全能干細(xì)胞，2006年由日本科學(xué)家Yamanaka首次獲得，由于其可避開倫理、免疫排斥等問題，干細(xì)胞再生與移植治療領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣泛。大量研究證明iPSCs可在體外分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSC)等，為腦卒中、腦

2、外傷、帕金森(Parkinson's disease，PD)、阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療帶來了可能。然而iPSCs向NSC分化的確切機(jī)制目前尚未明了。iPSCs與ESC具有相似的生物學(xué)特性，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)ESC的自我更新及分化受細(xì)胞外環(huán)境、Notch信號(hào)通路、Sirt1、miRNAs等多種因素的調(diào)控。 Notch信號(hào)通路在干細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，Notch

3、系統(tǒng)激活后干細(xì)胞增殖，而抑制Notch信號(hào)系統(tǒng)干細(xì)胞則分化加速;作為mir-34a下游靶基因的Sirt1對(duì)保證神經(jīng)元的完整性及神經(jīng)發(fā)育的順利進(jìn)行至關(guān)重要。本課題組通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)“RA+無血清培養(yǎng)基”法可提高小鼠iPSCs向NSC定向分化效率;在此基礎(chǔ)上通過加入Sirt1抑制劑煙酰胺(nicotinamide，NAM)抑制Sirt1的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、免疫熒光等方法檢測神經(jīng)分化過程中Notch信號(hào)、Sirt

4、1、mir-34a及相關(guān)神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)變化，初步探討Sirt1、miRNAs及Notch信號(hào)分子等在iPSCs向NSC分化過程發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步闡明iPSCs向NSC定向分化的確切機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備:取E12.5d ICR小鼠胚胎，去頭尾、四肢、內(nèi)臟，消化成單細(xì)胞后培養(yǎng)，取P2-4代狀態(tài)良好胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblast cells，MEF)，10μg/ml的絲裂霉

5、素C處理2.5 h。⑵小鼠iPSCs的培養(yǎng)及向NSC的誘導(dǎo)分化:采用RA+無血清培養(yǎng)基法誘導(dǎo)小鼠iPSCs向NSC分化，并利用免疫熒光染色鑒定分化細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志物(Nestin、SOX2、Tublin3及GFAP)的表達(dá)。⑶采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測小鼠iPSCs向NSC分化過程各時(shí)間點(diǎn)Notch信號(hào)、Sirt1、mir-34a及Nestin等的表達(dá)變化。⑷加入Sirt1抑制劑NAM，觀察Sirt1在小鼠iPSCs向NSC誘導(dǎo)分化過程中的作用

6、對(duì)及其Notch信號(hào)、mir-34a表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)分為自然分化組、RA對(duì)照組、RA+NAM誘導(dǎo)組。免疫熒光染色鑒定神經(jīng)標(biāo)志物Nestin、SOX2、β-tubulinⅢ、GFAP蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)定量PCR比較小鼠iPSCs向NSC分化過程各組Notch1、Sirt1、mir-34a、Nestin mRNA的表達(dá);Western bolt檢測各時(shí)間點(diǎn)Notch1、Sirt1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：①“無血清培養(yǎng)基+RA誘導(dǎo)法”可成

7、功將小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為NSC。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)iPSCs經(jīng)RA結(jié)合無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)，OCT4-GFP綠色熒光蛋白表達(dá)逐漸減少;倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)過程不斷有神經(jīng)樣細(xì)胞爬出，貼壁培養(yǎng)14天后細(xì)胞形成神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);免疫熒光染色顯示細(xì)胞高表達(dá)Nestin、SOX2等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物;NSC在無血清培養(yǎng)基中飼養(yǎng)2月，傳至P10代仍保持良好狀態(tài)。②實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:與iPSCs相比，在小鼠iPSCs向NSC分化過程中

8、Notch1、Sirt1 mRNA表達(dá)下調(diào)，后期NSC增殖過程表達(dá)上調(diào);mir-34a及神經(jīng)干標(biāo)志物Nestin mRNA表達(dá)均持續(xù)顯著上調(diào)。③加入Sirt1抑制劑NAM后，神經(jīng)球貼壁速度及其周圍神經(jīng)細(xì)胞爬出速率加快;免疫熒光染色顯示NAM誘導(dǎo)組較自然分化組和RA組神經(jīng)標(biāo)志物Nestin、SOX2、β-tubullinⅢ及GFAP的表達(dá)增高;western blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)加入NAM后Sirt1、Notch信號(hào)被抑制，使