PD-1-PD-L信號(hào)通路對(duì)人心房顫動(dòng)免疫調(diào)控的研究.pdf

1、心房顫動(dòng)（AtrialFibrillation,AF）是臨床最常見的心律失常，然而，房顫的病理生理機(jī)制卻沒有完全闡明。目前，越來越多的證據(jù)支持免疫炎癥反應(yīng)和房顫的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，研究證明C反應(yīng)蛋白（CRP）和白介素-6（IL-6）等血漿炎癥因子和抗M2毒蕈堿受體等自身抗體在房顫患者大量增加，活化的T淋巴細(xì)胞在房顫患者心肌內(nèi)膜浸潤。然而，目前尚無充分的證據(jù)能完全闡明此免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控的分子機(jī)制。
　　T細(xì)胞活化需要經(jīng)典的雙信號(hào)作用。

2、第一信號(hào)來自抗原與受體結(jié)合，即T細(xì)胞受體（TCR）與抗原肽（MHC分子復(fù)合物）結(jié)合時(shí)，抗原識(shí)別信號(hào)可通過CD3分子傳入胞內(nèi)。第二信號(hào)來自協(xié)同刺激信號(hào)，抗原提呈細(xì)胞（APC）或靶細(xì)胞與T細(xì)胞之間輔助分子作用可作為T細(xì)胞活化的第二信號(hào)。第一信號(hào)分子標(biāo)志物有CD69和人類白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）等，CD69是II型跨膜糖蛋白，是淋巴細(xì)胞早期活化標(biāo)志，HLA-DR是主要組織相容性復(fù)合物（MHC）II類分子，在抗原提呈和輔助激活T淋巴細(xì)胞

3、中起作用，屬于后期淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志。該分子的高表達(dá)提供第一信號(hào)調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)的激活。
　　B7：CD28家族在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化或耐受的過程中提供第二信號(hào)，其不僅提供積極的第二個(gè)信號(hào)，維持和促進(jìn)T細(xì)胞的反應(yīng)，也能提供關(guān)鍵負(fù)性的第二信號(hào)，下調(diào)T細(xì)胞的反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受，因此，其被認(rèn)為在免疫活化過程中起關(guān)鍵的平衡作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，B7：CD28家族有很多抑制T細(xì)胞活化的通路，近年發(fā)現(xiàn)的程序性死亡因子-1（PD-1）及配體（PD-L）通

4、路由于獨(dú)特抑制功能備受關(guān)注。PD-1主要與APC表面的PD-L結(jié)合發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化功能，干擾素α、β和γ是PD-L1表達(dá)的上調(diào)因子，其可促進(jìn)PD-L1在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)明顯增加。目前，PD-1/PD-L信號(hào)通路被認(rèn)為在T細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其在自身免疫性疾病和感染性疾病中得到了廣泛研究。PD-L由于其在心血管系統(tǒng)的高表達(dá)，也被認(rèn)為在心血管疾病中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，目前，PD-1/PD-L信號(hào)通路在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病

5、、自身免疫性心肌炎和自身免疫性擴(kuò)張型心肌病的作用已有研究。然而，PD-1/PD-L信號(hào)通路是否參與了房顫的發(fā)生發(fā)展，目前尚無報(bào)道，T細(xì)胞活化是否參與房顫的發(fā)病機(jī)理也不十分明確。
　　本研究以房顫患者為研究對(duì)象，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD69和HLA-DR在CD3+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)水平；PD-1在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)水平；PD-L在髓系樹突狀細(xì)胞（mDCs）、巨噬細(xì)胞、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)水平；以流

6、式技術(shù)CBA法檢測(cè)血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ炎性細(xì)胞因子濃度。分析CD69、HLA-DR、PD-1/PD-L和炎性細(xì)胞因子在房顫患者外周血的表達(dá)特點(diǎn)及其表達(dá)水平的高低與細(xì)胞免疫活性之間的關(guān)系。體外淋巴細(xì)胞混合增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD-L水平的改變對(duì)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的影響，進(jìn)一步研究α干擾素上調(diào)PD-L1在mDCs表達(dá)后對(duì)免疫活性的影響，以期闡明CD69、HLA-DR和PD-1/PD-L

7、信號(hào)通路在房顫發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，從而為房顫的病理生理機(jī)制提供新的理論依據(jù)。為此，本研究主要完成以下工作：
　　1.收集和分析外周血T細(xì)胞表面CD69和HLA-DR的表達(dá)特點(diǎn)
　　按入選標(biāo)準(zhǔn)篩選我科確診的房顫病人，分為陣發(fā)性房顫組和持續(xù)性房顫組，另選取無心律失常發(fā)作的自愿者為對(duì)照組，收集其外周靜脈血，整理相關(guān)臨床資料，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD3+T細(xì)胞表面CD69和HLA-DR的表達(dá)水平，分析其表達(dá)特點(diǎn)。
　　

8、2.血PD-1和PD-L的表達(dá)特點(diǎn)分析
　　利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平，mDCs、巨噬細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上的PD-L1及PD-L2的表達(dá)水平，分析其表達(dá)特點(diǎn)。
　　3.IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ細(xì)胞因子濃度特點(diǎn)分析
　　利用流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測(cè)患者血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和

9、IFN-γ細(xì)胞因子濃度，分析其特點(diǎn)。
　　4.PD-1/PD-L信號(hào)通路對(duì)房顫患者T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響
　　分離外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及mDCs，用房顫組和對(duì)照組的mDCs與另一個(gè)健康人的CD4+或CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，行同種異體淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，采用[3H]-TdR摻入法檢測(cè)mDCs刺激T細(xì)胞增殖能力，及對(duì)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ細(xì)胞因子分泌的影響。使用

10、α干擾素上調(diào)PD-L1在mDCs上的表達(dá)，研究PD-L1表達(dá)上調(diào)對(duì)mDCs刺激T細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞因子分泌能力的影響。
　　結(jié)果
　　1.CD69和HLA-DR在房顫患者外周血中CD3+T細(xì)胞上表達(dá)水平明顯增加。2.PD-1在房顫患者CD4+T細(xì)胞上表達(dá)水平明顯下調(diào)，其受體PD-L1在mDCs上的表達(dá)水平也顯著下調(diào)，且持續(xù)性房顫患者較陣發(fā)性房顫患者下調(diào)更明顯。
　　3.房顫組患者的IL-2、IL-6、IL-10和IFN

11、-γ血漿濃度明顯升高，持續(xù)性房顫患者較陣發(fā)性房顫患者更明顯，IL-4、IL-17A和TNF血漿濃度和對(duì)照組無明顯差異。
　　4.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，房顫患者mDCs刺激異源性T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌能力比對(duì)照組明顯升高，α干擾素上調(diào)mDCs的PD-L1表達(dá)后，其刺激異源性T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌能力明顯降低。
　　結(jié)論
　　1.PD-1/PD-L1路徑通過CD4+T細(xì)胞/mDCs作用參與房顫的免疫調(diào)控，PD-1/PD