PD-1-PD-L信號(hào)參與慢性乙肝病毒感染特異性CTL功能衰竭的研究.pdf

1、乙型肝炎是嚴(yán)重的肝臟感染性疾病。目前全世界慢性HBV感染者已經(jīng)超過4億，乙肝相關(guān)肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。由于目前HBV感染后慢性化的確切機(jī)制尚不清楚，所以無法制定出行之有效的治療方法和方案。 HBV作為嗜肝性DNA病毒，本身對(duì)肝細(xì)胞并沒有損害，在清除病毒和造成肝細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用的是CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。急性乙肝病毒感染可激發(fā)強(qiáng)烈的多表位特

2、異性CTL應(yīng)答；但慢性感染時(shí)，特異性CTL增殖、細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞毒效應(yīng)功能均發(fā)生不同程度損傷，與HBV感染持續(xù)不能清除直接相關(guān)，其原因仍待研究。 T細(xì)胞的分化、活化及發(fā)揮效應(yīng)功能除了需要來自TCR的第一信號(hào)，還需要來自共刺激分子的輔助調(diào)節(jié)信號(hào)。PD-1是CD28家族的共刺激分子，與配體PD-L結(jié)合后可阻斷TCR信號(hào)的傳遞。眾多研究表明，PD-1/PD-L共刺激信號(hào)通路在T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌等各個(gè)過程中均發(fā)揮重要的負(fù)

3、性調(diào)節(jié)作用。2006年，Barber小組的研究工作發(fā)現(xiàn)，在淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)感染小鼠體內(nèi)，功能衰竭的T細(xì)胞表達(dá)PD-1上調(diào)，阻斷PD-1與其配體之間的相互作用能使衰竭的T細(xì)胞恢復(fù)活力并顯著降低病毒載量。此后，在HIV，HCV等慢性病毒感染性中也相繼發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1通路與病毒特異性CD8+T細(xì)胞功能障礙有關(guān)，該通路在慢性HBV感染中的研究也已初見報(bào)道。但是， PD-1/PD-L通路對(duì)HBV特異性CTL分化、活化

4、過程的影響目前仍不清楚，而特異性CTL的分化和活化是其發(fā)揮效應(yīng)功能的基礎(chǔ)。另一方面，PD-1/PD-L通路在HBV的感染的靶器官——肝臟中的表達(dá)及其與疾病發(fā)展的關(guān)系仍未見報(bào)道。 因此，為更全面地認(rèn)識(shí)PD-1/PD-L共刺激信號(hào)通路在乙型肝肝炎病毒慢性感染中對(duì)特異性CTL功能的調(diào)節(jié)作用，我們開展了以下研究：首先，利用多色流式細(xì)胞儀結(jié)合pentamer技術(shù)檢測了PD-1分子在HBV特異性CTL的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，慢性乙肝患者HBV

5、特異性CTL表達(dá)PD-1百分率顯著增高，顯著高于作為對(duì)照的CMV特異性CTL及外周血總CD8+T細(xì)胞。而分析PD-1的表達(dá)水平與患者血漿病毒載量及性別、年齡和ALT水平之間關(guān)系顯示， PD-1的表達(dá)水平與血漿中HBV病毒的載量正相關(guān)，與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性。以上結(jié)果提示，可能是患者體內(nèi)高載荷的HBV病毒引起了PD-1表達(dá)的上調(diào)。 那么PD-1表達(dá)的上調(diào)對(duì)特異性CTL的分化、活化及多種抗病毒效應(yīng)功能是否發(fā)生影響呢？結(jié)合表面分化抗原

6、CD27、CD45RA和趨化因子受體CCR7的表達(dá)，我們觀察了在T細(xì)胞不同分化階段PD-1表達(dá)的變化，我們發(fā)現(xiàn)在CTL細(xì)胞分化的不同階段，PD-1表達(dá)存在顯著差異。CCR7+ CD27+CD45RA+初始CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)極少，在遭遇抗原后(CD45RA') PD-1表達(dá)上調(diào)。在分化中期CCR7-CD27+CD45RA-T細(xì)胞上PD-1表達(dá)達(dá)到最高。而分化至終末階段的CCR7-CD27-CD45RA+T細(xì)胞中，PD-1表達(dá)又復(fù)下

7、調(diào)。PD-1表達(dá)與CTL分化之間存在明顯關(guān)聯(lián)。而慢性乙肝感染患者特異性CTL多集中于分化中后階段，高表達(dá)PD-1分子；但作為對(duì)照的CMV特異性CTL大多高分化，PD-1表達(dá)水平較低的。因此，分化與PD-1表達(dá)的差異使HBV特異性CTL可能接收更強(qiáng)的抑制信號(hào)。 通過表面活化標(biāo)志檢測，我們發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內(nèi)PD-1+ CTL高表達(dá)活化標(biāo)志CD38和HLA-DR。接著利用胞內(nèi)因子染色法檢測抗病毒效應(yīng)分子的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)PD-1+特異

8、性CTL胞內(nèi)仍有較高的GrB的表達(dá)，但performn表達(dá)低下、IFN-γ表達(dá)極低。以上表型提示慢性乙肝患者PD-1+特異性CTL雖然高度活化，但實(shí)際處于功能受損狀態(tài)。 PD-1/PD-L通路的抑制效應(yīng)不僅取決于PD-1的表達(dá)量，還取決于PD-1與其配體配接的程度，因此慢性HBV感染時(shí)PD-L的表達(dá)量也至關(guān)重要。于是我們檢測了外周血淋巴和單核細(xì)胞中PD-1配體PD- L1和PD-L2的表達(dá)。結(jié)果顯示，慢性乙肝患者外周血單核細(xì)胞

9、表面PD-L1表達(dá)顯著上調(diào)，而T和B淋巴細(xì)胞群體表面PD-L1的表達(dá)無顯著變化，同時(shí)PD-L2在單核和淋巴細(xì)胞中的表達(dá)也沒有顯著變化。結(jié)合患者臨床信息分析發(fā)現(xiàn)，外周血單核細(xì)胞PD-L1的表達(dá)量與血漿ALT水平顯著正相關(guān)。這可能提示，在肝臟炎癥增加的同時(shí)機(jī)體也開始上調(diào)免疫抑制因子以控制炎癥損傷程度。 慢性乙肝感染時(shí)單核細(xì)胞上調(diào)PD-L1表達(dá)是否抑制特異性T細(xì)胞的應(yīng)答？阻斷PD-1/PD-L1通路又是否能夠恢復(fù)特異性T細(xì)胞的功能？為

10、回答上述問題，我們進(jìn)行了PD-1/PD-L1通路阻斷實(shí)驗(yàn)：分離慢性乙肝感染患者外周血PBMC進(jìn)行體外培養(yǎng)，其中加入特異性表位肽刺激特異性CTL發(fā)生活化和增殖，在以上體系中利用PD-L1的阻斷性抗體阻斷PD-1/PD-L通路后觀察特異性CTL增殖和效應(yīng)功能的變化。結(jié)果顯示，加入阻斷性抗體以后，特異性CTL的增殖能力顯著增強(qiáng)，清除病毒的重要效應(yīng)因子IFN-γ的分泌能力顯著提高。上述結(jié)果提示，在慢性HBV感染患者外周血中，PD-1/PD-L1

11、通路參與特異性CTL的功能障礙的調(diào)節(jié)，阻斷該通路能使功能受損的特異性CTL的增殖和細(xì)胞因子分泌效應(yīng)功能恢復(fù)。 肝臟是HBV特異性感染的靶器官，且有研究表明PD-1/PD-L1通路參與肝內(nèi)T細(xì)胞免疫耐受的調(diào)節(jié)。因此，為闡述PD-1/PD-L這一重要的免疫調(diào)節(jié)通路在慢性乙肝感染肝臟的表達(dá)及其在疾病進(jìn)程中的可能作用，我們進(jìn)行了以下研究：首先，利用免疫組織化學(xué)方法檢測了PD-1在慢性乙肝感染患者肝活檢組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，慢性乙肝

12、感染肝組織中PD-1陽性細(xì)胞顯著增加，且PD-1分子主要表達(dá)在匯管區(qū)和肝小葉中浸潤單個(gè)核細(xì)胞上。免疫雙熒光染色實(shí)驗(yàn)提示，PD-1表達(dá)在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞以及少量CD20+B淋巴細(xì)胞上。這提示，在慢性乙肝感染肝臟中浸潤著大量活化的淋巴細(xì)胞，它們表達(dá)PD-1分子上調(diào)。 接著我們檢測了PD-1的兩個(gè)配體在慢性乙肝感染肝臟中的表達(dá)。結(jié)果顯示，PD-L1的表達(dá)在HBV慢性感染肝臟中顯著上調(diào)，除了浸潤炎癥細(xì)胞以外，Kupffer'

13、s細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞及DC細(xì)胞等大量肝臟原位抗原遞呈細(xì)胞均上調(diào)PD-L1的表達(dá)。而另一個(gè)配體PD-L2的表達(dá)則沒有顯著變化。比較炎癥損傷程度不同及炎癥細(xì)胞浸潤程度不同的肝組織中原位抗原遞呈細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與肝組織炎癥損傷和炎癥細(xì)胞浸潤程度均密切相關(guān)。上述結(jié)果提示，肝組織的炎癥損傷和免疫應(yīng)答上調(diào)了肝臟原位抗原遞呈細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，這可能起到控制免疫反應(yīng)強(qiáng)度，保護(hù)肝組織的作用。因此，PD-1/PD-L