IFN-γ對(duì)單核細(xì)胞分化、MICs表達(dá)的影響以及MICs在單核細(xì)胞-NK-T細(xì)胞“對(duì)話”中的作用.pdf

1、NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞分別是天然及適應(yīng)性細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞?；罨腘K細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞具有相似的效應(yīng)功能：針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的分泌，其中IFN-γ是活化NK細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞分泌的最常見(jiàn)和最重要的細(xì)胞因子。IFN-γ不僅具有直接的抗病毒作用，更能對(duì)體內(nèi)多種細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞自身)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和修飾的作用。 NKG2D是一種表達(dá)于NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及γδTCR+T細(xì)胞表面的活化受體，由NK

2、G2D啟動(dòng)的信號(hào)可直接活化NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；對(duì)于T細(xì)胞，NKG2D提供重要的共刺激信號(hào)。MHC-Ⅰ類(lèi)鏈相關(guān)分子(MICs)是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較充分的NKG2D受體的配體。MICs定位于HLA-Ⅰ類(lèi)基因區(qū)，在MICA-MICG七個(gè)成員中，目前認(rèn)為MICA及MICB是能夠被轉(zhuǎn)錄翻譯的功能基因。作為一種應(yīng)激的標(biāo)記分子，MICs廣泛表達(dá)于處于熱休克、氧化應(yīng)激、感染及惡變的細(xì)胞表面，當(dāng)它被NK/T細(xì)胞表面的NKG2D受體識(shí)別并結(jié)合后，即可啟動(dòng)N

3、K細(xì)胞或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致這些“異常”細(xì)胞被清除。MICs分子也低水平表達(dá)于正常腸上皮細(xì)胞、某些內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞表面；在單核細(xì)胞、某些角質(zhì)細(xì)胞及活化的T細(xì)胞胞漿內(nèi)，也檢測(cè)到MIC蛋白的表達(dá)。正常細(xì)胞表面低水平或陰性表達(dá)MICs分子，可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。 單核細(xì)胞是單核-巨噬系統(tǒng)的主要成份。體內(nèi)單核細(xì)胞正常情況下處于免疫靜息狀態(tài)，但在適宜的條件作用下，它可以通過(guò)轉(zhuǎn)化為DCs或者分泌大量細(xì)胞因子來(lái)參與或調(diào)節(jié)

4、免疫應(yīng)答。最近研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞與NK細(xì)胞或T細(xì)胞之間存在著對(duì)話機(jī)制，并且淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ及細(xì)胞間的直接接觸可能是介導(dǎo)單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但對(duì)于IFN-γ在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞之間對(duì)話的具體分子機(jī)制，目前仍不清楚。考慮到NKG2D在調(diào)控淋巴細(xì)胞活化及其在天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的重要“橋梁”作用，我們猜測(cè)NKG2D受體/配體系統(tǒng)極可能也參與了IFN-γ介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞之間的對(duì)話。 雖然HB

5、V特異性T細(xì)胞應(yīng)答是機(jī)體清除HBV的關(guān)鍵，但NK細(xì)胞在HBV感染早期控制病毒復(fù)制及輔助HBV特異性CTLs產(chǎn)生方面也扮演重要角色。HBV慢性感染常常伴有NK細(xì)胞數(shù)量和功能的下降，另一方面，慢性乙肝患者對(duì)外源性IFN-γ治療呈低反應(yīng)性。HBV慢性感染的NK細(xì)胞功能受損是否與單核細(xì)胞與NK細(xì)胞間交互互作用障礙有關(guān)?IFN-γ對(duì)慢性乙肝患者單核細(xì)胞是否有正常的免疫調(diào)節(jié)和修飾作用?也是有待回答的問(wèn)題。 基于以上研究背景和存在問(wèn)題，本文從

6、以下方面進(jìn)行了相關(guān)研究： 1、從健康志愿者PBMCs中分選單核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和形態(tài)觀測(cè)的方法檢測(cè)了細(xì)胞因子IFN-γ、FNF-α、IFN-α僅刺激前后單核細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和有關(guān)表型分子CD14、CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)變化； 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IFN-α對(duì)正常PBMCs、分選的原代單核細(xì)胞以及單核細(xì)胞系U937、THP-1表面MIC表達(dá)的影響；

7、 3、采用RT-PCR及Westernblot檢測(cè)了IFN-γ，刺激前后單核細(xì)胞MICs的表達(dá)； 4、將IFN-γ刺激的單核細(xì)胞與異體NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞活化標(biāo)志分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)，同時(shí)以51Cr釋放試驗(yàn)分析了NK細(xì)胞對(duì)其靶細(xì)胞K562細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，觀察單核細(xì)胞表面MICs分子及膜結(jié)合型IL-15(mIL-15)在NK細(xì)胞活化及NKG2D受體維持中的作用； 5、采用磁珠活化N

8、K細(xì)胞，收集活化NK細(xì)胞培養(yǎng)上清，與單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，再將單核細(xì)胞與自體CD8+CD28-T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞MICs及T細(xì)胞活化相關(guān)分子CD25、CD62L的表達(dá)； 6、采用流式細(xì)胞術(shù)及51Cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)了IFN-γ刺激的慢性乙肝患者單核細(xì)胞與正常人NK細(xì)胞共培養(yǎng)后，NK細(xì)胞的活化分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)，以及NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力； 7、流式細(xì)胞檢測(cè)并比較了IFN-γ刺激后

9、，15例健康志愿者及13例慢性乙肝患者單核細(xì)胞表面MICs及mIL-15的表達(dá)差異。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、IFN-γ能促進(jìn)單核細(xì)胞粘附聚集，單核細(xì)胞簇集形成獨(dú)特的“細(xì)胞小島”樣結(jié)構(gòu)，IFN-γ刺激的單核細(xì)胞呈梭形或多角形，表面有突起形成；IFN-α有較微弱的促進(jìn)單核細(xì)胞簇集的作用，IFN-α刺激的單核細(xì)胞形成較多突起，形似星形；TNF-α對(duì)單核細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響； 2、IFN-γ刺激5day后，單核細(xì)胞同時(shí)具有DCs

10、及單核細(xì)胞表型特征，體現(xiàn)為由CD14+CD1a-CD83-轉(zhuǎn)變?yōu)镃D14+CD1a+CD83+，但CD14表達(dá)水平明顯下降，IFN-γ還能促進(jìn)單核細(xì)胞CD80、CD86及HLA-DR的表達(dá)；IFN-α也能促進(jìn)單核細(xì)胞CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表達(dá)，能下調(diào)CD14表達(dá)，但不能上調(diào)CD1a表達(dá)，上調(diào)CD83的能力較弱；TNF-α對(duì)上述分子表達(dá)無(wú)明顯影響； 3、RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示，新鮮分離單

11、核細(xì)胞組成性表達(dá)MICA及MICB的轉(zhuǎn)錄體和蛋白，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞表面無(wú)或微弱地表達(dá)MICs分子；用MICs交叉反應(yīng)性抗體行流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以選擇性上調(diào)PBMCs中單核細(xì)胞表面MICs表達(dá)；以MICA特異性及MICB特異性抗體行流式細(xì)胞術(shù)及Westernblot檢測(cè)，卻發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激的單核細(xì)胞MICA及MICB表達(dá)均無(wú)明顯上調(diào)，提示IFN-γ可能促進(jìn)單核細(xì)胞某種未知的MIC分子表達(dá)；細(xì)胞因子TNF-α、IFN-

12、α對(duì)單核細(xì)胞MICs表達(dá)無(wú)影響； 4、IFN-γ刺激的單核細(xì)胞能促進(jìn)異體NK細(xì)胞CD69及胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)，能增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；單核細(xì)胞的這種效應(yīng)至少部分依賴(lài)于IFN-γ上調(diào)的MICs分子，因?yàn)橛每筂ICs抗體封閉或用細(xì)胞小室阻斷細(xì)胞接觸，可以顯著地抑制NK細(xì)胞的活化；IFN-γ誘導(dǎo)上調(diào)的mIL-15能保護(hù)NK細(xì)胞免于MICs誘導(dǎo)的NKG2D受體下調(diào)； 5、活化NK細(xì)胞分泌的IFN-γ能促進(jìn)單核細(xì)胞

13、表面MICs及mIL-15表達(dá)，單核細(xì)胞經(jīng)活化的NK細(xì)胞培養(yǎng)上清作用后，能上調(diào)自體CD8+CD28-T細(xì)胞CD25表達(dá)并下調(diào)CD62L的表達(dá)，單核細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的mIL-15有助于維持CD8+CD28-T細(xì)胞表面NKG2D的正常水平； 6、IFN-γ刺激的慢性乙肝患者單核細(xì)胞與正常人NK細(xì)胞共培養(yǎng)，不能上調(diào)NK細(xì)胞的活化分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)，也不能增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力；對(duì)IFN-γ刺激后，15例健

14、康志愿者及13例慢性乙肝患者單核細(xì)胞表面MIC及mIL-15的表達(dá)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者單核細(xì)胞MICs及mIL-15陽(yáng)性率低于健康志愿者(分別為21.10％±5.72％vs42.61％±15.39％，及12.77％±4.31％vs28.93％±5.77％)，二者相比有顯著性差異(p＜0.01)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來(lái)源于淋巴細(xì)胞的IFN-γ對(duì)單核細(xì)胞有重要的免疫調(diào)節(jié)和修飾作用。IFN-γ促進(jìn)單核細(xì)胞向成熟DCs分化；I

15、FN-γ選擇性上調(diào)PBMCs中單核細(xì)胞mIL-15及某種未知MIC分子(非MICA或MICB)的表達(dá)；單核細(xì)胞表面上調(diào)的MICs分子能夠刺激NK細(xì)胞活化；活化NK細(xì)胞分泌的IFN-γ作用于單核細(xì)胞后，單核細(xì)胞又能依賴(lài)MICs分子共刺激CD8+T細(xì)胞；單核細(xì)胞表面同時(shí)上調(diào)表達(dá)的mIL-15能夠保護(hù)NK細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞免受MICs誘導(dǎo)的NKG2D受體下調(diào)；慢性乙肝患者單核細(xì)胞對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的MICs及mIL-15上調(diào)存在應(yīng)答缺陷，這可