LPS刺激對(duì)單核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響.pdf

1、背景
　　膿毒癥(sepsis)是由感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征,是機(jī)體對(duì)外源性致病微生物如細(xì)菌、真菌、病毒等進(jìn)行免疫應(yīng)答過(guò)程中所出現(xiàn)的失控的炎癥反應(yīng)并最終可能導(dǎo)致多器官功能障礙。膿毒癥發(fā)病率高,大多病情危重,加之治療技術(shù)手段有限,因而成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)所面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。病原體入侵機(jī)體后可被機(jī)體的抗原提呈分子識(shí)別,繼而與炎癥細(xì)胞結(jié)合,啟動(dòng)炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放。失衡的炎癥細(xì)胞活化及炎癥因子釋放,通過(guò)影響血流動(dòng)力學(xué)、凝血及

2、細(xì)胞凋亡等機(jī)制進(jìn)一步損害各臟器的功能。目前膿毒癥尚缺乏特效分子靶向治療,以使用抗生素、強(qiáng)化液體管理及實(shí)施支持治療為主導(dǎo)的治療策略并未能顯著降低膿毒癥患者的病死率,盡管2002年巴塞羅那宣言上提出通過(guò)集束化管理等措施在5年內(nèi)減少25％膿毒癥患者病死率的遠(yuǎn)景目標(biāo),但最終只減少了近6.2%的病死率。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,由21～25個(gè)核苷酸組成,通過(guò)形成miRNA核蛋白體復(fù)合物(miRNPs)與靶

3、標(biāo)mRNA的堿基完全或部分配對(duì),從而產(chǎn)生抑制或降解作用,調(diào)控目的基因的表達(dá)。研究表明,miRNA可在膿毒癥信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡及器官功能障礙等多個(gè)病理生理過(guò)程起調(diào)控作用,參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞部分miRNA的表達(dá)變化明顯,可進(jìn)入血液循環(huán),成為潛在的膿毒癥分子標(biāo)志物。單核細(xì)胞系在膿毒癥早期炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)性的作用,而脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組分,也是目前研究最為透徹的病原相關(guān)分子模式,可通過(guò)刺激單核細(xì)胞誘發(fā)膿毒癥早期炎

4、癥反應(yīng)。研究單核細(xì)胞在膿毒癥發(fā)生后miRNA表達(dá)譜的變化,有助于進(jìn)一步明確膿毒癥的發(fā)病機(jī)制,阻斷膿毒癥的疾病進(jìn)程。
　　目的：
　　1.研究THP-1細(xì)胞在LPS刺激下其miRNA表達(dá)譜的變化。
　　2.為進(jìn)一步研究miRNA對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用提供參考,并尋找可能的診斷性能優(yōu)越的膿毒癥分子標(biāo)志物。
　　內(nèi)容與方法
　　1.培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用THP-1細(xì)胞并傳代,凍存及復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。
　　2.分別以0ng/

5、ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/mlLPS刺激THP-1細(xì)胞,在刺激后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)收集細(xì)胞上清液,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)不同LPS刺激濃度、不同刺激時(shí)長(zhǎng)的細(xì)胞上清液內(nèi)的IL-6水平,探索適宜的炎癥刺激條件。
　　3.實(shí)驗(yàn)組以1000ng/mlLPS刺激THP-1細(xì)胞,對(duì)照組只添加RPMI-1640,每組各4個(gè)培養(yǎng)孔,48小時(shí)后分離培養(yǎng)液及細(xì)胞。ELISA法對(duì)培養(yǎng)液內(nèi)的

6、IL-6水平進(jìn)行測(cè)定,對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.采用PBS洗液洗滌實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組離心后分離得到的細(xì)胞,通過(guò)Trizo法提取總RNA并將其轉(zhuǎn)移入2mlEP管內(nèi),空白對(duì)照組4管標(biāo)記1、2、3、4,實(shí)驗(yàn)組4管標(biāo)記5、6、7、8,進(jìn)行妥善的封裝后放置于-80℃冰箱內(nèi)。
　　5.委托博奧生物有限公司進(jìn)行AgilentmiRNAmicroarray芯片檢測(cè),采用AgilentFetureExtraction(v10.7)、Ag

7、ilentGeneSpring、GeneSpring等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度LPS刺激THP1細(xì)胞在不同的時(shí)間段細(xì)胞所釋放的IL-6水平不同,刺激濃度越大,IL-6水平越高(P<0.05)。
　　2.從對(duì)數(shù)折線圖上可以看出,THP-1細(xì)胞IL-6分泌呈現(xiàn)出高度時(shí)間依賴性,刺激24小時(shí)以后IL-6水平顯著升高。
　　3.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,部分miRNA出現(xiàn)顯著改變,實(shí)驗(yàn)組hsa

8、-miR-21-5P、hsa-miR-146a-5P及hsa-miR-29b-3p等部分miRNA出現(xiàn)顯著上調(diào),hsa-miR-16-5P、hsa-miR-92a-3P、hsa-let-7a-5P等部分miRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)(所有P值均在10-4～10-7之間)。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)毒素脂多糖(LPS)能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-6;
　　2.LPS刺激濃度越大,THP-1細(xì)胞分泌的IL-6水平越高,IL-6