明膠法富集外周血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：觀察明膠法分離外周血單核細(xì)胞的效率以及將分離出的單核細(xì)胞刺激成熟為樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)，觀察其形態(tài)及表型特征，并與普通塑料粘附法對比。
　　 方法：使用人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離人外周血得到外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，根據(jù)培養(yǎng)瓶是否進(jìn)行明膠包被分為明膠包被組（實驗組）和普通塑料組（對照組）。均分外周血單個核細(xì)胞，按不同分組分離

2、獲得單核細(xì)胞。
　　 在重組人白細(xì)胞介素4（recombinanthumaninterleukin-4，thIL-4）和粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,thGM-CSF)
　　 作用下刺激為非成熟樹突狀細(xì)胞，在促成熟雞尾酒組合重組人白細(xì)胞介素ip(recombinanthumaninterleukin-

3、ip，thIL-1β)、重組人白細(xì)胞介素6(recombinanthumaninterleukin-6，thIL-6)、重組人腫瘤壞死因子α（recombinanthumantumornecrosisfactor-a,thTNF-a）和
　　 前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)作用下誘導(dǎo)刺激為成熟樹突狀細(xì)胞。計數(shù)各組分離獲得的單核細(xì)胞數(shù)。鏡下觀察對比兩組血小板污染情況。流式細(xì)胞儀檢測兩組單核細(xì)胞的CD14、

4、CD3、CD19陽性率，分別代表所得單核細(xì)胞的純度、T、B淋巴細(xì)胞污染率。錐蟲藍(lán)拒染法計算單核細(xì)胞活率。單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞后鏡下觀察對比兩組所得樹突狀細(xì)胞的形態(tài)。使用流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞非成熟期和成熟期CDla，CD83的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:平均每組30ml外周血，普通塑料組和明膠包被組分別獲得(12.3±3.56)和(15.8±3.05)×106個單核細(xì)胞，兩組相比P＜0.05，差異有顯著性意義，表明明膠法分離獲

5、得的單核細(xì)胞多于普通塑料粘附法。鏡下觀察到普通塑料組的血小板污染率明顯高于明膠包被組。普通塑料組和明膠包被組所得單核細(xì)胞的CD14、CD3、CD19陽性率分別為(67.25±5.77)％和(81.56±5.83)％、(4.68±1.01)％和(2.89±0.81)％、(10.89±1.45)％和(7.68±1.54)％,各組相比P＜0.05，差異有顯著性意義，表明明膠法獲得的單核細(xì)胞的純度大于普通塑料粘附法，T、B淋巴細(xì)胞污染率低于普通

6、塑料粘附法。兩組細(xì)胞活率分別為(94.6±1.58)％和(95.2±1.64)％，相比P＞0.05，差異無顯著性意義，表明明膠法對細(xì)胞活力無明顯不利影響。兩組細(xì)胞刺激為樹突狀細(xì)胞后，均具有典型樹突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，非成熟期和成熟期表型CDla、CD83相比差異無顯著性意義，認(rèn)為明膠法對單核細(xì)胞刺激成熟為樹突狀細(xì)胞的功能無不利影響。
　　 結(jié)論:明膠法可以簡單高效分離出外周血中單核細(xì)胞并成功刺激其分化為具有典型形態(tài)學(xué)及成熟表型的