明膠法富集外周血單核細胞分化為樹突狀細胞的研究.pdf

1、目的：觀察明膠法分離外周血單核細胞的效率以及將分離出的單核細胞刺激成熟為樹突狀細胞(dendriticcell，DC)，觀察其形態(tài)及表型特征，并與普通塑料粘附法對比。
　　 方法：使用人淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離人外周血得到外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，根據培養(yǎng)瓶是否進行明膠包被分為明膠包被組（實驗組）和普通塑料組（對照組）。均分外周血單個核細胞，按不同分組分離

2、獲得單核細胞。
　　 在重組人白細胞介素4（recombinanthumaninterleukin-4，thIL-4）和粒一巨噬細胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,thGM-CSF)
　　 作用下刺激為非成熟樹突狀細胞，在促成熟雞尾酒組合重組人白細胞介素ip(recombinanthumaninterleukin-

3、ip，thIL-1β)、重組人白細胞介素6(recombinanthumaninterleukin-6，thIL-6)、重組人腫瘤壞死因子α（recombinanthumantumornecrosisfactor-a,thTNF-a）和
　　 前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)作用下誘導刺激為成熟樹突狀細胞。計數各組分離獲得的單核細胞數。鏡下觀察對比兩組血小板污染情況。流式細胞儀檢測兩組單核細胞的CD14、

4、CD3、CD19陽性率，分別代表所得單核細胞的純度、T、B淋巴細胞污染率。錐蟲藍拒染法計算單核細胞活率。單核細胞分化為樹突狀細胞后鏡下觀察對比兩組所得樹突狀細胞的形態(tài)。使用流式細胞儀檢測樹突狀細胞非成熟期和成熟期CDla，CD83的表達情況。
　　 結果:平均每組30ml外周血，普通塑料組和明膠包被組分別獲得(12.3±3.56)和(15.8±3.05)×106個單核細胞，兩組相比P＜0.05，差異有顯著性意義，表明明膠法分離獲

5、得的單核細胞多于普通塑料粘附法。鏡下觀察到普通塑料組的血小板污染率明顯高于明膠包被組。普通塑料組和明膠包被組所得單核細胞的CD14、CD3、CD19陽性率分別為(67.25±5.77)％和(81.56±5.83)％、(4.68±1.01)％和(2.89±0.81)％、(10.89±1.45)％和(7.68±1.54)％,各組相比P＜0.05，差異有顯著性意義，表明明膠法獲得的單核細胞的純度大于普通塑料粘附法，T、B淋巴細胞污染率低于普通

6、塑料粘附法。兩組細胞活率分別為(94.6±1.58)％和(95.2±1.64)％，相比P＞0.05，差異無顯著性意義，表明明膠法對細胞活力無明顯不利影響。兩組細胞刺激為樹突狀細胞后，均具有典型樹突狀細胞的形態(tài)學特征，非成熟期和成熟期表型CDla、CD83相比差異無顯著性意義，認為明膠法對單核細胞刺激成熟為樹突狀細胞的功能無不利影響。
　　 結論:明膠法可以簡單高效分離出外周血中單核細胞并成功刺激其分化為具有典型形態(tài)學及成熟表型的