不同來(lái)源動(dòng)物全血或單核細(xì)胞以及人源單核細(xì)胞系體外熱原檢測(cè)的方法學(xué)研究.pdf

1、目的：本課題以人體發(fā)熱機(jī)理為試驗(yàn)原理，研究二類(lèi)體外模型：①動(dòng)物全血及單核細(xì)胞，②人源單核細(xì)胞系，考察它們用于檢測(cè)熱原的可行性，以期建立新的體外熱原檢測(cè)體系，并對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用研究。
　　方法：(1)采用大鼠全血，以細(xì)胞因子（TNF-α）為檢測(cè)指標(biāo)；采用大鼠外周血單核細(xì)胞，以細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）為檢測(cè)指標(biāo)；(2)采用豬全血，以細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6）為檢測(cè)指標(biāo)；(3)采用家兔外周血單核細(xì)胞，以細(xì)胞因子（I

2、L-1β、IL-6、TNF-α）為檢測(cè)指標(biāo)；(4)采用人源單核細(xì)胞系 THP1，以 TNF-α（THP1細(xì)胞液 V:熱原樣品 V=4:1及1:1）和Neo（THP1細(xì)胞液 V:熱原樣品 V=4:1）為檢測(cè)指標(biāo)；(5)采用人源單核細(xì)胞系28SC，以細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）為檢測(cè)指標(biāo)，考察無(wú)活化物存在以及活化物 calcitriol濃度為10、100ng/ml時(shí)活化28SC后對(duì)各類(lèi)熱原的反應(yīng)活性，確定檢測(cè)指標(biāo)以及活化物

3、calcitriol的濃度，建立28SC熱原檢測(cè)體系，及研究不同傳代次數(shù)（15、45代）對(duì)28SC穩(wěn)定性的影響；(6)采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的熱原復(fù)合物和內(nèi)毒素法檢查不合格的樣品 b型流感疫苗，對(duì)人源單核細(xì)胞系28SC進(jìn)行應(yīng)用性研究。
　　對(duì)上述試驗(yàn)進(jìn)行熱原檢測(cè)的可行性研究。
　　結(jié)果：(1)大鼠全血-TNF-α-法，大鼠外周血單核細(xì)胞-IL-1β、IL-6法對(duì)LPS不能檢測(cè)到0.5EU/ml（前期結(jié)果表明，LPS引起家兔體溫升高

4、0.6℃的最小濃度為0.5EU/ml），不適用于檢測(cè)熱原；大鼠外周血單核細(xì)胞-TNF-α法，對(duì)LPS可檢測(cè)到0.25EU/ml，適用于檢測(cè)熱原；(2)豬全血-IL-1β法對(duì)LPS的最低檢測(cè)限為0.125EU/ml，線(xiàn)性范圍為0.0125~0.5EU/ml，R=0.9754；豬全血-IL-6法對(duì)LPS的最低檢測(cè)限為0.0625EU/ml，線(xiàn)性范圍為0.0625~0.5EU/ml，R=0.9959，豬全血-IL-1β、IL-6法適用于檢測(cè)熱

5、原；(3)兔外周血單核細(xì)胞-IL-1β、IL-6、TNF-α法對(duì)LPS不能檢測(cè)到0.5EU/ml，不適用于檢測(cè)熱原；(4) THP1-TNF-α法的兩種孵育體系對(duì)LPS均不能檢測(cè)到0.5EU/ml；THP1-Neo法對(duì)LPS不能檢測(cè)到0.5EU/ml，兩種指標(biāo)均不適用于檢測(cè)熱原；(5)無(wú)活化物存在時(shí)，28SC-IL-1β、IL-6、TNF-α法對(duì)LPS不能檢測(cè)到0.5EU/ml；活化物 calcitriol濃度為10ng/ml時(shí)，28S

6、C- IL-1β、TNF-α法對(duì)LPS不能檢測(cè)到0.5EU/ml，28SC-IL-6法對(duì)LPS可檢測(cè)到0.25EU/ml，對(duì)LTA不能檢測(cè)到0.5μg/ml(前期結(jié)果表明，LTA引起家兔體溫升高0.6℃的最小濃度為0.5μg/ml），對(duì)Zymosan不能檢測(cè)到16.0μg/ml(前期結(jié)果表明，Zymosan引起家兔體溫升高0.6℃的最小濃度為16.0μg/ml）；活化物 calcitriol濃度為100ng/ml時(shí)，28SC-IL-1β

7、、TNF-α法對(duì)LPS可檢測(cè)到0.5EU/ml，對(duì)LTA不能檢測(cè)到0.5μg/ml，對(duì)Zymosan不能檢測(cè)到16.0μg/ml，28SC-IL-6法對(duì)LPS可檢測(cè)到0.25EU/ml，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.031EU/ml，線(xiàn)性范圍為0.031~0.5EU/ml，R=0.9432，對(duì)LTA可檢測(cè)到0.5μg/ml，對(duì)Zymosan可檢測(cè)到16.0μg/ml，該體系適用于檢測(cè)熱原；確定28SC熱原檢測(cè)體系的活化物 calcitriol濃度

8、為100ng/ml，檢測(cè)指標(biāo)為細(xì)胞因子 IL-6；經(jīng) LPS刺激后，45代28SC各劑量組與15代相應(yīng)劑量組 IL-6含量之間無(wú)顯著性差異，對(duì)LPS的最低檢測(cè)限均可達(dá)到0.031EU/ml，線(xiàn)性范圍均為0.031~0.5EU/ml，R15=0.9975，R45=0.9961；(6)對(duì)于熱原復(fù)合物，28SC熱原檢測(cè)體系對(duì)其最低可檢測(cè)到其16倍稀釋液，而同稀釋倍數(shù)樣品不能引起家兔法體溫升高，檢測(cè)方法靈敏度前者高于后者，對(duì)于 b型流感疫苗，2

9、8SC熱原檢測(cè)體系與細(xì)菌內(nèi)毒素法判定結(jié)果一致。
　　結(jié)論：(1)動(dòng)物全血及單核細(xì)胞類(lèi)模型：大鼠外周血單核細(xì)胞-TNF-α法、豬全血-IL-1β、IL-6法適用于檢測(cè)熱原，但其適用性尚需進(jìn)一步研究；(2)人源單核細(xì)胞系類(lèi)模型：體外28SC-IL-6熱原檢測(cè)體系，適用于檢測(cè)熱原，對(duì)LPS的最低檢測(cè)限為0.031EU/ml，對(duì)LTA可檢測(cè)到0.5μg/ml，對(duì)Zymosan可檢測(cè)到16.0μg/ml；該體系穩(wěn)定性好，在45代時(shí)尚有較好的