Latcripin-5的克隆表達、純化及其生物學活性的研究.pdf

1、香菇C91-3菌株是由我課題組多年篩選得到的一株藥用真菌。本實驗組經過對香菇C91-3菌株轉錄組多年的測序和其功能的解析，從而初步的篩選出17條與細胞活性相關的基因。我們通過利用RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends，快速cDNA末端擴增)技術獲得所篩選基因序列的全長。本實驗研究關注的是經帥選出的所有功能基因中的第5條基因，所以將其命名為latcripin-5基因（簡稱為LP-5）。我們通過對lat

2、cripin-5基因的生物信息學比對，從而得出該基因具有降解核酸的作用。
　　目的:
　　本實驗主要是通過構建香菇C91-3菌株pET32a(+)-latcripin-5的原核重組表達載體，并使原核重組表達載體在大腸桿菌Ecoli.R中進行誘導表達。通過對誘導表達產物的生物學活性的檢測，來確定香菇中具有對細胞核酸發(fā)生降解作用和生物活性作用的功能性蛋白。①通過生物信息學軟件尋找并確定Latcripin-5基因序列及其功能蛋白。

3、②將構建的重組原核表達載體中的Latcripin-5基因轉入大腸桿菌Ecoli.R中進行誘導表達，并對誘導表達的產物進行生物學活性及功能的鑒定，為探討其對細胞核酸作用的機制做好充分的準備。
　　方法:
　　第一部分:
　　①從被篩選出的香菇C91-3菌株中的菌絲體中提取全部的RNA，本實驗室根據轉錄組測序得到的數據結果，用RACE技術獲得latcripin-5基因全長，利用生物信息學軟件對Latcripin-5蛋白的理

4、化性質、氨基酸組成進行分析，并對Latcripin-5蛋白的功能結構域進行預測。②將latcripin-5的功能域基因Endonuclease-NS克隆到原核表達載體pET32a(+)中，從而構建出pET32a(+)-latcripin-5這種原核重組表達質粒。③將此原核重組表達質粒轉化到大腸桿菌Ecoli.R中并對其進行誘導表達，將誘導表達的產物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和Westernblot的方法進行鑒

5、定。④用鎳柱親和層析的方法來分離純化重組表達的Latcripin-5蛋白。
　　第二部分:
　　①把得到的純化的重組表達Latcripin-5蛋白進行復性和除鹽以及濃縮，并將濃縮后的蛋白進行濃度測定。②將得到的復性并濃縮后的蛋白與人類基因組DNA作用，用酶切的方法檢測復性所得蛋白的活性的是否存在。③將已確定活性存在的不同濃度的Latcripin-5蛋白作用于人肺癌細胞A549和雞胚細胞，用MTT(Methyl Thiazol

6、y LtetraZolium，四甲基偶氮唑藍)的方法測定Latcripin-5蛋白對細胞的抑制作用。④用33258熒光染色法、流式細胞術的方法檢測Latcripin-5蛋白對細胞凋亡和細胞周期的作用;用電鏡法檢測Latcripin-5蛋白對細胞的微型結構的作用。
　　結果:
　　第一部分:
　　①利用雙酶切的實驗方法確定插入到pET32a(+)中的基因片段為latcripin-5的基因片段。通過對Latcripin-5

7、蛋白結構域進行分析，證明Latcripin-5蛋白的結構域為非限制性核酸內切酶(Endonuclease-NS)的結構域。②運用SDS-PAGE電泳和Western blot方法得到的結果顯示大腸桿菌Ecoli.R所表達的蛋白為Latcripin-5蛋白。③SDS-PAGE電泳可以看出經鎳柱親和層析的到了純化的目的蛋白。
　　第二部分:
　?、賁DS-PAGE電泳和Western blot結果顯示得到了復性除鹽并濃縮后的蛋白

8、。②測定表達蛋白濃度時我們運用Bradford的方法，得到標準蛋白的直線方程為y=0.0537x+0.0021，R2=0.9950。③用重組表達的蛋白進行酶切的方法得到的結果顯示，該蛋白對核酸具有濃度梯度、溫度梯度依賴性。④用MTT的方法檢測得到的結果顯示，不同濃度的Latcripin-5蛋白對腫瘤細胞的生長抑制作用與對照組比較明顯的差異，而不同濃度此蛋白對雞胚細胞的生長抑制作用與對照組同樣比較有差異。⑤用流式細胞術得到的結果顯示，此蛋

9、白具有誘導細胞凋亡的作用，Latcripin-5蛋白的濃度為200μg/ml時誘導凋亡的作用最強;此蛋白對細胞周期檢測的結果顯示，在200μg/ml的Latcripin-5蛋白作用下目的蛋白作用后主要阻滯在細胞的G1期，G2期的細胞比例不變，S期的細胞所占比例減少。⑥33258熒光染色法觀察細胞凋亡結果顯示，細胞核有明顯的皺縮現象。⑦電鏡法檢測其對腫瘤細胞微型結構結果顯示，細胞的細胞核發(fā)生明顯的降解現象，細胞變大，胞漿濃度降低。

10、　　結論:
　?、賹y序得到的香菇C91-3菌株的全部轉錄組序列進行基因比對，根據基因功能注釋的初步結果，本實驗室成功獲得了latcripin-5基因的全長。②本實驗組成功構建了pE T32a(+)-latcripin-5的重組質粒;重組表達的Latcripin-5蛋白在大腸桿菌Ecoli.R中得到了成功表達;Latcripin-5蛋白經鎳柱親和層析的方法被成功純化。③Latcripin-5蛋白對人類基因組核酸具有酶切作用，同時對