芽孢桿菌amyF基因的克隆、表達(dá)、產(chǎn)物純化及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，應(yīng)用PCR方法從芽孢桿菌Bacillus sp.WS06構(gòu)建的全基因組DNA文庫(kù)中擴(kuò)增了α-淀粉酶基因amyF，并將其克隆到原核表達(dá)載體pET-21a中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETAF，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了較高表達(dá)。推測(cè)amyF編碼的蛋白有526個(gè)氨基酸、分子量為58.6 kD；amyF基因經(jīng)核苷酸序列測(cè)定，與已報(bào)道的Bacillus megaterium的α-淀粉酶基因序列有著93％的同源性。經(jīng)氨基

2、酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，AmyF含有淀粉酶家族中四個(gè)高度保守的酶催化活性區(qū)。經(jīng)多步純化后，達(dá)到電泳純的重組酶的比活比粗酶液提高了22.2倍，獲得凝膠電泳均一的蛋白樣品；經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定，AmyF酶分子量為57kD。為了進(jìn)一步研究抗性淀粉在腸道中微生物發(fā)酵與淀粉酶的關(guān)系，設(shè)計(jì)了抗性淀粉的動(dòng)物飼喂試驗(yàn)，收集結(jié)腸末端內(nèi)容物，洗滌獲得混合菌體，簡(jiǎn)單模擬腸道內(nèi)環(huán)境，體外厭氧恒溫培養(yǎng)，采樣測(cè)定分析相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著抗性淀粉攝入水平的增加