人TRAIL分子胞外區(qū)的克隆、表達純化及生物學活性鑒定.pdf

1、TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligind)又叫Apo2L，是新近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，與TNF-α和FasL一樣能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。但TNF-α和FasL的細胞毒副反應太大，無法應用于臨床。TRAIL有較廣的抗癌譜，能誘導對FasL和放化療有抗性的細胞凋亡，尤其在其抗癌作用中最獨特的特征是只選擇性誘導腫瘤細胞和轉化細胞發(fā)生凋亡，而對正常組織和細胞沒有顯著毒性效應。這一特殊的選擇性使TRAI

2、L在腫瘤治療中具有很大的應用前景，因此，有必要對其進行研究開發(fā)。 TRAIL分子的活性部分位于第114～281氨基酸，近來有研究報道，氨基酸95位前的序列具有抑制TRAIL誘導的細胞凋亡能力，較短的重組可溶性TRAIL分子具有較高的生物學活性。胞外區(qū)41～281氨基酸片斷是全長的可溶性TRAIL分子，含有胞外區(qū)的所有遺傳信息，目前尚未見有關這一片斷的研究報道。本實驗運用基因工程的原理和方法克隆編碼人胞外區(qū)41～281片斷的cDN

3、A，并將其插入原核表達載體pQE-80L中誘導蛋白表達，經純化復性后，獲得有生物學活性的重組可溶性人TRAIL41～281分子(rhsTRAIL41～281)。這既能為下一步探討41～114氨基酸殘基間是否存在輔助的功能位點奠定基礎，也有利于研究胞外區(qū)可溶性分子的長短與其功能的關系，同時也可為臨床上多種惡性腫瘤的治療提供新型候選劑。 本文的主要研究方法、內容及結論如下：①利用RT-PCR技術從HL-60細胞總RNA中擴增編碼人T

4、RAIL胞外區(qū)41～281氨基酸片斷的cDNA，經DNA測序后證實，擴增片斷的序列與GenBank報道的完全一致。 ②將測序正確的人TRAIL胞外區(qū)41～281氨基酸片斷的cDNA插入高效原核表達載體pQE-80L，限制性酶切鑒定結果表明，成功構建了重組pQE-80L/hTRAIL41～281質粒。 ③用重組表達載體轉化大腸桿菌DH5α，IPIG誘導融合蛋白表達，SDS-PAGE進行鑒定。結果獲得相對分子量為30.5KD

5、a左右的特異表達蛋白，且表達量占細菌總蛋白的45％左右。 ④經鑒定表達蛋白以包涵體的形式存在。對包涵體進行分離溶解后，用Ni-NTA樹脂進行純化，得到純度在90％以上的目的蛋白。 ⑤采用分步透析法復性蛋白，Westernblot證實該蛋白為rhsTRAIL41～281。通過凝膠過濾層析分離出復性蛋白的三種不同大小分子，分別與rhsTRAIL41～281的三聚體、二聚體和單體相對應，進一步證實這是目的蛋白。同時三聚體的存在

6、為rhsTRAIL41～281發(fā)揮其生物學功能奠定了基礎。 ⑥選用Jurkat細胞，采用多種方法檢測rhsTRAIL41～281的體外抗腫瘤能力。rhsTRAIL41～281處理的Jurkat細胞的形態(tài)及生長狀況通過顯微鏡觀察、臺盼藍排斥試驗和MTT試驗進行檢測。顯微鏡下觀察到Jurkat細胞表現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學特征，同時臺盼藍和MTT試驗結果也顯示rhsTRAIL41～281分子能有效抑制Jurkat細胞的生長，并且該作用有明顯

7、量效和時效關系。 應用流式細胞儀和DNA斷裂實驗檢測細胞凋亡。流式細胞儀結果表明，rhsTRAIL41～281能有效誘導Jurkat細胞發(fā)生凋亡，并且這一效應呈良好量效與時效關系。DNA斷裂實驗的結果顯示，經誘導的細胞出現(xiàn)了典型的DNA梯形條帶，這一凋亡的特征性變化進一步證實rhsTRAIL41～281蛋白具有較好的抗腫瘤活性，并且提示該蛋白能通過誘導細胞凋亡的方式抑制細胞生長和殺傷腫瘤細胞，從而發(fā)揮其抗癌作用。 ⑦41