雷帕霉素及環(huán)孢素對(duì)人類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外提取培養(yǎng)人類外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)，并驗(yàn)證其免疫抑制功能;分別觀察雷帕霉素及環(huán)孢素對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞體外增殖的影響，初步探討其可能機(jī)制。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分，人類外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外提取培養(yǎng)及功能驗(yàn)證:取新鮮健康成人外周血50～100mL，利用密度梯度離心法得到外周血單核細(xì)胞，然后使用人類CD4+CD2

2、5+CD127dim/-T細(xì)胞分離試劑盒Ⅱ，通過(guò)免疫磁珠法進(jìn)一步提取得到CD4+CD25+Treg細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4、CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞純度，然后取一部分細(xì)胞進(jìn)行羧基熒光素乙酰乙酸染色，連同未經(jīng)染色細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，添加含CD3/CD28單克隆抗體所包被的磁珠及高濃度重組人IL-2等的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37.5℃、飽和濕度、5％CO2濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，7天后將染色細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)明確其增

3、殖情況，其余未染色CD4+CD25+Treg細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7天，定期更換培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞傳代;將免疫磁珠法陽(yáng)性選擇中所保留的CD4+CD25-T細(xì)胞（效應(yīng)性T細(xì)胞）用羧基熒光素乙酰乙酸標(biāo)記后與同種同體CD4+CD25+Treg細(xì)胞1∶1混合培養(yǎng)7天，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)觀察分析CD4+CD25-T細(xì)胞的受抑制情況;笫二部分，雷帕霉素及環(huán)孢素對(duì)人體外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞體外增殖的影響:將提取所得CD4+CD25+Tr

4、eg細(xì)胞全部進(jìn)行羧基熒光素乙酰乙酸標(biāo)記，然后將細(xì)胞分成三組，每組至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行培養(yǎng)，在加入上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，第一組添加濃度為100nmol/L的雷帕霉素試劑，第二組添加濃度為410nmol/L的環(huán)孢素試劑，第三組為空白對(duì)照組，不添加任何其他試劑。三組細(xì)胞于相同環(huán)境下培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基并添加相應(yīng)試劑，7天后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析兩種藥物對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞體外增殖的影響。數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，

5、結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:通過(guò)密度梯度離心法結(jié)合免疫磁珠法共提取CD4+CD25+Treg細(xì)胞15例，其中1例出現(xiàn)細(xì)胞污染，6例雙陽(yáng)性率低于80％，予以丟棄，其余8例CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度達(dá)到(97±0.8)％，且細(xì)胞內(nèi)Foxp3表達(dá)率達(dá)(99±0.5)％。CD4+CD25+Treg細(xì)胞體外正常分化增殖，適宜條件下培養(yǎng)7天后流式細(xì)胞儀檢測(cè)

6、原代細(xì)胞比例占(37.0±3.5)％，14天后光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增至150倍左右;體外CD4+CD25+Treg細(xì)胞與CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞1∶1混合培養(yǎng)7天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞原代細(xì)胞比例占(79.4±6.9)％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CD4+CD25+Treg細(xì)胞可明顯抑制CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。
　　 第二部分:雷帕霉素組中CD4+CD25+Treg細(xì)胞培養(yǎng)7天后

7、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代細(xì)胞所占比例為（8.8±3.2）％，空白對(duì)照組中原代細(xì)胞所占比例為（33.2±4.3）％，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知雷帕霉素明顯促進(jìn)了CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外增殖(P＜0.05);相反的，經(jīng)檢測(cè)環(huán)孢素組中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞培養(yǎng)7天后原代細(xì)胞所占比例為（48.9±7.0）％，與空白對(duì)照組相比，環(huán)孢素明顯抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外增殖(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 ①

8、免疫磁珠法提取得到的CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度可達(dá)到95％以上，F(xiàn)oxp3表達(dá)率達(dá)99％以上，且具有省時(shí)高效、便于操作等眾多優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行CD4+CD25+Treg細(xì)胞相關(guān)研究的理想提取方式;
　　 ②雷帕霉素對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外增殖起著明顯促進(jìn)作用，而環(huán)孢素則抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的增殖分化，可見(jiàn)從CD4+CD25+Treg細(xì)胞的角度分析，雷帕霉素一定程度上有利于移植后患者免疫耐受的形成，而