雷帕霉素對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:體外誘導(dǎo)分化內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),然后應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素干預(yù),探討干預(yù)后的EPCs生物學(xué)特性的變化,為下肢深靜脈血栓等疾病的治療提供一種新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1.密度梯度離心法獲取Wistar大鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bonemarrow-derived mononuclear cells,BMMNCs),內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2MV)體外誘導(dǎo)分化

2、為EPCs,然后將貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成5組,一組為對(duì)照組(正常培養(yǎng)組),其余4組分別加入含雷帕霉素0.01、0.1、1、10μg/L的EGM-2MV培養(yǎng)基中,各組分別培養(yǎng)24、48h。2.MTT比色法觀察其增殖能力。3.單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法檢測(cè)自噬囊泡.4.透射電鏡觀察雷帕霉素對(duì)EPCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響5.Westernblot檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的變化6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和周期進(jìn)程。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行

3、分析。
　　 結(jié)果:1、EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)Ficoll法分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以誘導(dǎo)生成EPCs；2.經(jīng)雷帕霉素作用后測(cè)定的OD值呈明顯降低的趨勢(shì),對(duì)照組明顯高于干預(yù)組(P<0.05)。3.MDC成功對(duì)自噬囊泡染色,可以比較直觀的觀察到自噬囊泡的存在與熒光強(qiáng)度隨著隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增強(qiáng)。4.透射電鏡下見(jiàn)線粒體腫脹、自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)邊集等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。5.雷帕霉素作用細(xì)胞后LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)明