2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目前,空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)感染已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎最常見的病因之一。更具嚴重后果的是該菌與格林一巴利綜合征(Guillain-Barr~syndrome,GBS)有非常密切的關系,是導致GBS發(fā)生的重要前驅(qū)感染原。但是,由于目前對C.jejuni的遺傳學特性、毒力因子、致病作用和C.jejuni誘發(fā)GBS的機制尚不完全明了,至今仍缺少有效而可行措施來預防C.jejuni腹瀉和GBS

2、的發(fā)生。為此,本研究針對C.jejuni是一種多變、易變的腸道感染細菌,利用DNA疫苗誘導特異性體液免疫、細胞免疫的優(yōu)勢和殼聚糖增強粘膜吸收、緩釋等特性,設計制備了具有高效粘膜免疫應答的C.jejuni多價DNA疫苗。并探討其在小鼠體內(nèi)誘導特異性免疫應答的效應和在小鼠C.jejuni攻擊模型中的免疫保護力,以及其在應用中的周圍神經(jīng)安全性問題。為深入開發(fā)新型C.jejuni疫苗奠定理論基礎。課題分四部分: 第一部分 空腸彎曲菌多價

3、DNA疫苗的構(gòu)建及其表達 目的:利用基因工程技術(shù)分別構(gòu)建C.jejunicadF和peblA基因的真核表達重組質(zhì)粒,并以此重組質(zhì)粒DNA為核心,通過殼聚糖包裹DNA,構(gòu)建C.jejuni多價DNA疫苗。并評價殼聚糖作為DNA疫苗遞呈系統(tǒng),其促進DNA疫苗在真核細胞中表達的有效性和安全性。 方法:(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定:分別以C.jejuniHS:2、‘HS:8、HS:19和HS:21的基因組DNA為模板,進行PCR擴

4、增,獲得四種血清型的cadF和peblA基因DNA片段,并測序比較HS:2和HS:19peblA基因的同源性。在此基礎上,選擇與GBS最為相關的C.jejuniHS:19cadF和peblA基因PCR純化產(chǎn)物為目的基因DNA片段,分別定向插入真核表達載體pcDNA3.1(+),以構(gòu)建pcDNA3.1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定、PCR鑒定和DNA雙向測序確認。(2)重組質(zhì)粒在COS-

5、7細胞中表達:以重組質(zhì)粒DNA為核心,分別采用殼聚糖和PolyFect轉(zhuǎn)染試劑包裹DNA,制備殼聚糖-DNA和PolyFect-DNA,轉(zhuǎn)染COS-7細胞,RT-PCR方法檢測其瞬時表達,ELISA檢測其在COS-7細胞中的表達產(chǎn)物。(3)MTT法檢測殼聚糖-DNA的細胞毒性。 結(jié)果:(1)PCR反應顯示四種血清型C.jejuni的cadF和peblA基因DNA片段大小一致,DNA雙向測序證實C.jejuniHS:19peblA

6、基因序列與HS:2peblA基因序列具有高度同源性。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)雙酶切和PCR鑒定,以及DNA雙向測序證實目的基因插入成功。(2)采用RT-PCR方法能夠從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中擴增出與目的基因大小一致的DNA片段。ELISA分析表明在COS一7細胞培養(yǎng)上清中可獲得目的基因表達產(chǎn)物。并且,殼聚糖一DNA組與PolyFect-DNA組相比較,其轉(zhuǎn)染效率和表達水平更高,轉(zhuǎn)染后3d,其表達水平增高了5.1倍,PolyFect

7、-DNA組僅增高了2.9倍(P<0.01)。(3)MTT法檢測顯示,殼聚糖-DNA組與PolyFect-DNA組相比較,其轉(zhuǎn)染細胞存活率更高,轉(zhuǎn)染后3d,殼聚糖-DNA組90%左右的細胞生長良好、形態(tài)正常,而PolyFect-DNA組細胞的存活率降至65%左右(P<0.01)。 結(jié)論:(1)C.jejunicadF和peblA基因具有高度的保守性,以此成功構(gòu)建的pcDNA3.1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA

8、重組質(zhì)粒均能在COS-7細胞中有效表達。(2)殼聚糖-DNA遞呈系統(tǒng)是安全、高效的DNA疫苗遞呈系統(tǒng)。 第二部分 目的:評價Cjejuni多價DNA疫苗經(jīng)粘膜免疫后,誘導特異性體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應答的效應。 方法:(1)378只6周BALB/c小鼠被分為9個大組,每組42只小鼠。于實驗開始的0、7、14和2l天,以未干預組、pcDNA3.1(+)組和殼聚糖組為對照,分別將不同效價的C.jejuniDNA

9、疫苗滴鼻免疫小鼠,包括:pcDNA3。1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA(單抗原裸DNA疫苗)、pcDNA3.1(+)一cadF+pcDNA3.1(+)一peblA(雙抗原裸DNA疫苗)、殼聚糖-pcDNA3.1(+)一cadF和殼聚糖-pcDNA3.1(+)一peblA(殼聚糖一單抗原DNA疫苗),以及殼聚糖-pcDNA3.1(+)一cadF+pcDNA3.1(+)一peblA(殼聚糖一雙抗原DNA疫苗)。(2)流

10、式細胞計量儀檢測末次免疫后4周小鼠外周血CD4+、CD8+T細胞分類情況。(3)ELISA檢測末次免疫后2、4、6和8周小鼠血清中細胞因子IFN-7、IL-4和特異性抗體IgA、IgG、IgM水平,以及小鼠糞便中IgA抗體水平。(4)末次免疫后8周各組隨機抽取6只小鼠,取其小腸組織行免疫組織化學檢查,以觀察小鼠腸壁SIgA的變化。 結(jié)果:(1)各實驗組與各對照組相比較:①末次免疫后4周,各實驗組小鼠外周血CD4+、CDs+T細胞

11、數(shù)有顯著性升高(P<0.01);②末次免疫后2、4、6和8周,小鼠血清中IFN-~、IL-4和IgA、IgG、Igm水平,以及糞便中IgA水平,與對照組相比較均存在顯著性差異(P<0.01),各對照組小鼠血清中上述各項參數(shù)一直無變化。各實驗組小鼠血清IFN-7、IL-4、IgA、IgG、IgM和糞便IgA水平均從免疫后2周開始上升,4周達頂峰,到第6周和8周時殼聚糖-DNA疫苗組維持在較高的水平(IgM抗體除外),而裸DNA疫苗組則迅速

12、下降;③末次免疫后8周,腸壁SIgA免疫組化染色顯示,各實驗組小鼠其小腸粘膜固有層可見不同程度的棕色顆粒沉著,呈(+)~(+++)反應,而各對照組僅表現(xiàn)為(-)~(土)反應。(2)對應時期各實驗組相比較,上述各項指標均以殼聚糖.雙抗原DNA疫苗組為最高,殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之,單抗原裸DNA疫苗組最低(P<0.01)。但是,殼聚糖一單抗原DNA疫苗組間比較和單抗原裸DNA疫苗組間比較均無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論

13、:C.jejuni多價DNA疫苗經(jīng)鼻免疫小鼠后,能在小鼠體內(nèi)激發(fā)顯著而持久的特異性體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應答。 第三部分 空腸彎曲茵多價DNA疫苗的免疫保護性研究 目的:探討C.jejuni多價DNA疫苗在小鼠C.jejuni攻擊模型中的免疫保護力,測試該疫苗的實際有效性。 方法:(1)末次免疫后第8周,分別采用HS:l9或HS:2單次和HS:19重復攻擊的方式進行C.jejuni不同嚴重度的灌胃攻擊。(

14、2)實施C.jejuni攻擊后,對各種C.jejuniDNA疫苗的免疫保護作用進行比較性評價,包括觀測疾病指數(shù)以判斷疫苗的臨床保護效率;大便培養(yǎng)以判斷疫苗對C.jejuni腸道定植的清除效應;肝組織勻漿培養(yǎng)以評價疫苗阻止C.jejuni感染向腸道外擴散的效力。(3)C.jejuniHS:19末次重復攻擊后第4周,各組隨機抽取6只小鼠取其小腸組織,行免疫組織化學檢查,以觀察腸壁SIgA的同步改變。(4)C.jejuni末次攻擊后第4周和1

15、2周,取其坐骨神經(jīng)分別用于原纖維分離檢查、半薄切片光鏡檢查和超薄切片電鏡檢查以觀察疫苗阻止C.jejuni感染誘發(fā)周圍神經(jīng)免疫損傷的效力。并取其小腸和肝臟組織進行H&E染色組織病理學檢查。 結(jié)果:(1)C0ejuni攻擊后引起對照組小鼠明顯組織病理學異常,包括:①小腸組織不同程度的充血水腫、炎性細胞浸潤;②肝臟組織顯示細胞質(zhì)疏松、氣球樣變性、點狀壞死和灶性壞死,并伴有炎性細胞浸潤;③坐骨神經(jīng)組織發(fā)生以軸索變性為主的免疫性損傷。(

16、2)各實驗組和各對照組在C.jejuniHS:19重復攻擊時,其疾病指數(shù)、C.jejuni腸道定植率、C.jejuni腸道外(肝臟)感染擴散率和受檢器官病變發(fā)生率均顯著高于HS:19或HS:2單次攻擊(P<0.01);HS:19單次攻擊時,其坐骨神經(jīng)病變發(fā)生率又明顯高于HS:2單次攻擊(P<0.01)。(3)與對照組相比,各C.jejuniDNA疫苗均能不同程度地保護免疫后小鼠免遭C.jejuniHS:19重復攻擊和HS:2的感染攻擊,

17、明顯減少C.jeiuni的腸道定植率,有效防止C.jejuni的血行擴散,顯著降低受攻擊小鼠的疾病指數(shù)和受檢器官病變發(fā)生率(P<0.01)。其中,殼聚糖一雙抗原DNA疫苗組的免疫保護作用最強,殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之,單抗原裸DNA疫苗組最低。(4)C.jejuniHS:19重復攻擊后第4周,免疫組織化學檢測顯示小鼠腸壁SIgA呈同步性改變。 結(jié)論:(1)C.jejuni重復攻擊比單次攻擊具有更強的感染致病力,可作為C.j

18、ejuni對被免疫動物強化攻擊的有效模型。C.jejuniHS:19比HS:2具有更高的致周圍神經(jīng)免疫性損傷的危險性。(2)C.iejuni多價DNA疫苗滴鼻免疫小鼠后,能在小鼠體內(nèi)激發(fā)顯著而有效的特異性免疫應答,有效地保護免疫后小鼠抵御C.jejuni重復感染攻擊,明顯減少該菌在宿主腸道定植和腸道外擴散,顯著降低被攻擊小鼠疾病指數(shù),并伴有腸壁SIgA同步性分泌增多。(3)C.jejuni多價DNA疫苗在有效抵御C.jejuni腸道感染

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