實時定量PCR檢測人類腹瀉糞便中空腸彎曲菌的研究與評價.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，以下簡稱C.jejuni)是近二十幾年來被普遍認識的世界范圍廣泛流行的人獸共患病原菌，可以引起人和動物發(fā)生各種疾病。本菌為彎曲菌屬的一個種，被認為是人類細菌性腸炎的主要病因之一。本菌致病后臨床表現(xiàn)主要有兩種：消化道癥狀和/或腸道外感染。目前本菌的檢測主要依靠實驗室分離培養(yǎng)，包括直接培養(yǎng)法、增菌后培養(yǎng)法和過濾培養(yǎng)法。這幾種方法繁瑣、費時，并且最后還需要做十幾種生化試驗來鑒定，結果往往在5

2、.7天以后才有，延誤了疾病的診斷和相應治療。因此，國內外相繼開展了利用分子生物學及免疫學方法對空腸彎曲菌進行快速檢測的研究，包括定性分析的PCR技術、寡核苷酸探針技術、ELISA及免疫磁珠等，但這些方法一般用于對純菌的快速篩選及食品、水源等的檢測，尚未成熟應用于檢測人類腹瀉糞便中的空腸彎曲菌。因此，本研究欲應用實時定量PCR技術建立快速準確的空腸彎曲菌臨床診斷方法。 研究目的：建立一種快速準確的方法以檢測人類腹瀉糞便中的空腸彎曲

3、菌，并將其應用于臨床檢驗中。 材料和方法： 1.收集住院和門診腹瀉病人的糞便256例及正常人糞便50例。 2.應用3種培養(yǎng)基(空腸彎曲菌選擇性血瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、CCDA平板)以過濾培養(yǎng)法同時鑒定306例糞便是否含有空腸彎曲菌，以提高培養(yǎng)結果的可靠性。 3.應用針對空腸彎曲菌ORF-C特異性片段而設計的引物和探針進行實時定量PCR反應(TaqMan探針法)，檢測空腸彎曲菌(5株)、彎曲菌菌屬內的其他菌

4、種(6種)及其他腸道細菌(17種)，以檢驗引物和探針的特異性。通過檢測經倍比稀釋的空腸彎曲菌純培養(yǎng)物和模擬感染糞便標本，以確定引物和探針的敏感性。 4.以稀釋液混勻后提取306例糞便的細菌基因組DNA，并應用此引物和探針進行檢測。最后比較real-timePCR和培養(yǎng)方法結果的吻合度。 5.實驗過程中，培養(yǎng)結果和實時定量PCR結果是雙盲的，直至實驗結束。 結果： 1.空腸彎曲菌選擇性血瓊脂和哥倫比亞血瓊脂

5、均從256例腹瀉糞便中檢測到10例陽性樣本；CCDA平板檢測到9例。3種培養(yǎng)基均未從50例正常糞便中檢出空腸彎曲菌。陽性標本中空腸彎曲菌的濃度主要集中在約104-106CFU/g。 2.引物和探針對空腸彎曲菌高度特異，與其他細菌無交叉反應。在純培養(yǎng)物和糞便中，最低檢測限分別約為102CFU/mL和103CFU/g。 3.在256例腹瀉糞便中，real-timePCR檢出12例陽性標本。其中2例培養(yǎng)陰性而PCR陽性的標本經

6、測序證實為空腸彎曲菌。Real-timePCR從50例正常糞便中沒有檢出空腸彎曲菌。 4.以培養(yǎng)方法為金標準，real-timePCR的特異度為99.2％，敏感度為100％，約登指數(shù)為0.992。經McNemar檢驗得知兩種檢測方法之間的差異無顯著性，二者吻合度較強(Kappa系數(shù)=0.905)。 結論： 1.引物和探針對空腸彎曲菌高度特異。敏感性試驗表明，引物和探針的最低檢測濃度能夠適用于臨床檢測中。