去甲腎上腺素對空腸彎曲菌的促生長作用鑒定及表達(dá)譜分析.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)為彎曲菌屬中的一種食源性病原細(xì)菌，主要感染人引起腹瀉和腸炎，而且與人自身免疫性疾病格林-巴利綜合癥密切相關(guān)，該菌在宿主腸道內(nèi)定居的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。人和動物腸道內(nèi)的主要神經(jīng)遞質(zhì)為去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)，研究顯示該激素可促進(jìn)多種細(xì)菌的生長及毒力增強，增強細(xì)菌在腸道內(nèi)定居的能力。因而鑒定去甲腎上腺素對空腸彎曲菌的促生長作用及表達(dá)譜分析將有助于理解空腸彎曲菌在腸

2、道定居及致病機(jī)理。
　　通過模擬宿主體內(nèi)細(xì)菌的生存環(huán)境，本試驗鑒定和篩選了NE對空腸彎曲菌的促生長作用。首先選擇MEM、MH、DMEM等三種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，分別篩選MEM培養(yǎng)基中胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)BS）濃度、NE濃度和細(xì)菌接種量，MH培養(yǎng)基中1，8-二氮-9-芴酮（1，8-diazafluoran-9-one，DFO）濃度、NE濃度和細(xì)菌接種量，DMEM培養(yǎng)基中細(xì)菌接種量，從而確定NE對細(xì)菌的最佳促生長

3、條件;然后鑒定NE合成通路中不同化學(xué)物質(zhì)、腎上腺素拮抗劑以及轉(zhuǎn)鐵蛋白對NE促空腸彎曲菌生長效果的影響。研究結(jié)果顯示，在MEM培養(yǎng)基中最佳促生長條件為NE濃度100μmol/L、FBS濃度10％和細(xì)菌接種濃度100 CFU/mL，在此條件下NE促生長效果最顯著;在MH培養(yǎng)基中NE濃度與細(xì)菌接種濃度篩選結(jié)果與MEM培養(yǎng)基一致，而DFO添加濃度在不同批次MH培養(yǎng)基中出現(xiàn)變化，導(dǎo)致在MH培養(yǎng)基中NE對細(xì)菌的促生長效果不穩(wěn)定;在DMEM培養(yǎng)基中，

4、未獲得穩(wěn)定且重復(fù)性好的NE促生長條件。對于NE化學(xué)合成通路中的6種化學(xué)物質(zhì)，具有3，4-二羥基苯環(huán)基團(tuán)的3，4-二羥基-L-苯丙氨酸、多巴胺、腎上腺素和NE均具有顯著的促生長效果，而缺乏此基團(tuán)的酪氨酸和苯丙氨酸則未檢測到明顯的促生長效果。在兩種腎上腺素受體拮抗劑普洛萘爾（β腎上腺素受體拮抗劑）和酚妥拉明（α腎上腺素受體拮抗劑）對NE促生長作用的鑒定中，酚妥拉明顯示具有一定的拮抗效果，但統(tǒng)計學(xué)差異不顯著，需要進(jìn)一步試驗鑒定。單獨添加乏鐵轉(zhuǎn)

5、鐵蛋白（Apotransferrin）的培養(yǎng)基中細(xì)菌不生長，添加Apotransferrin和NE后細(xì)菌生長緩慢;添加富鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holotransferrin)后，無論是否添加NE，細(xì)菌均快速生長。本試驗結(jié)果對研究NE對空腸彎曲菌的促生長作用機(jī)制具有重要意義。
　　為了在基因轉(zhuǎn)錄水平上鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機(jī)制，本試驗利用基因轉(zhuǎn)錄譜芯片技術(shù)檢測在NE作用下空腸彎曲菌中轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的基因，并對這些基因進(jìn)行功能聚類和蛋白

6、相互作用分析。針對空腸彎曲菌NCTC11168中的1654個基因設(shè)計探針利用基因表達(dá)譜芯片(Microarray)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，通過設(shè)定P≤0.05和差異倍數(shù)(Fold change)≥1.5的檢測限，共檢測89個差異表達(dá)基因，其中包括56個表達(dá)上調(diào)基因和33個表達(dá)下調(diào)基因，這些基因涵蓋了多個生物學(xué)過程，包括細(xì)菌代謝、信息儲存與處理及細(xì)胞變化過程與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，同時也參加了多條與鐵離子代謝有關(guān)的信號通路，包括ABC轉(zhuǎn)運信號通路、微生

7、物代謝有關(guān)的幾條信號通路。結(jié)果提示利用基因表達(dá)譜芯片可以篩選出NE作用下的差異表達(dá)基因，有助于鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機(jī)制。
　　為了在基因表達(dá)水平上鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機(jī)制，本試驗利用雙向凝膠電泳技術(shù)檢測NE作用下空腸彎曲菌中差異表達(dá)的蛋白，并利用質(zhì)譜分析技術(shù)對差異蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，雙向凝膠電泳共發(fā)現(xiàn)25個差異蛋白質(zhì)點，其中21個差異蛋白質(zhì)可以被質(zhì)譜分析鑒定，包含17種蛋白質(zhì)，其中多數(shù)蛋白為代謝酶或酶輔