致軸索型GBS空腸彎曲菌的wla基因簇序列對(duì)比研究.pdf

1、目的：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，C.jejuni)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌之一，部分吉蘭.巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是發(fā)生于C.jejuni感染后的周圍神經(jīng)疾病。根據(jù)不同的神經(jīng)生理學(xué)和病理學(xué)特點(diǎn)，GBS被分為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(AIDP)、急性運(yùn)動(dòng)軸索性神經(jīng)病(AMAN)、和Miller-Fisher綜合征(MFS)等幾種亞型?，F(xiàn)有大量研究表

2、明空彎表面的脂寡糖(LOS)成分和周圍神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂之間的分子模擬導(dǎo)致免疫損傷是空彎感染后GBS的主要發(fā)病機(jī)制。Wla基因簇編碼的多種蛋白參與了細(xì)菌表面LOS的生物合成。 本研究從基因突變的角度出發(fā)，選擇華北地區(qū)具有致AMAN型GBS特性的三株空腸彎曲菌菌株，對(duì)其LOS合成相關(guān)的wla基因簇序列進(jìn)行測(cè)定，以了解華北地區(qū)致軸索型GBS的空彎菌株核酸序列特征，并同GenBank中的空彎菌株相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比分析，尋找基因突變和變異與

3、致病性的關(guān)系，及菌株的基因地域特點(diǎn)。 方法：1 細(xì)菌培養(yǎng)選取分離自華北地區(qū)AMAN型GBS病人的C.jejuni菌株。血清分型為pennerO:19型，pennerO:2型，pennerO：5型。采用李春巖院士的培養(yǎng)方法培養(yǎng)C.jejuni。 2、DNA提取應(yīng)用promega 公司的Wizard基因提取試劑盒，提取C.jejuni基因組DNA。 3.PCR擴(kuò)增參考以往文獻(xiàn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳證實(shí)PCR產(chǎn)物。

4、 4、測(cè)序和拼接PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳證實(shí)后，由上海生物公司測(cè)序。以已知序列為模版，利用末端重復(fù)序列拼接測(cè)序結(jié)果得到wla基因簇完整序列。 5、進(jìn)化分析應(yīng)用Mega version 4軟件，計(jì)算3株C.jejuni的wla基因簇序列同GeneBank中已知全基因組序列的6株C.jejuni相應(yīng)位點(diǎn)的遺傳距離并構(gòu)建進(jìn)化樹。 6、序列對(duì)比應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST，將得到的3株C.jejuni的wla基因簇序列與空腸彎曲

5、菌NCTC11168菌株相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比分析，找出存在的突變。 結(jié)果：1 拼接后得到的3株菌的wla基因簇全長(zhǎng)約13kb，其中l(wèi)ulei株與NCTC11168株相似，編碼11個(gè)開放讀碼框，qiaoyuntao株和zhanxing株wla基因簇編碼12個(gè)開放讀碼框。在wlaK和wlaI之間，qiaoyuntao株和zhanxing株比lulei株多出wlaJ。三株菌wla基因簇的GC含量都在29.7％左右。 2、lulei

6、株、qiaoyuntao株和zhanxing株的wla基因簇分別與RM1221株、NCTC11168株、81-176株相似程度最高，但在zhanxing株中，基因的相似程度有差異，其中wlaC、wlaD、wlaE、wlaG、wlaH、wlaI與81-176同源性最高，從wlaM到wlaJ，這四個(gè)相鄰的ORF與NCTC11168株相似度最高。以基因簇中的單個(gè)基因?yàn)閱挝坏倪M(jìn)一步分析結(jié)果顯示，這9株C.jejuni的聚類關(guān)系并不一致，本地菌株

7、在一些基因中存在聚類現(xiàn)象。 3、本研究菌株與NCTC11168菌株序列分析結(jié)果表示菌株之間核苷酸序列同源性達(dá)98％以上。三株細(xì)菌wla基因簇的基因存在不同程度的突變。lulei株共有134個(gè)堿基變化，導(dǎo)致30個(gè)氨基酸突變，wlaB、wlaE、wlaL及wlaM表達(dá)中斷；qiaoyuntao株共有24個(gè)堿基改變，導(dǎo)致3個(gè)氨基酸突變，wlaG、wlaK、wlaM的表達(dá)中斷；zhanxing株共有221個(gè)堿基改變，導(dǎo)致37個(gè)氨基酸突變

8、，wlaB、wlaG、wlaK表達(dá)中斷。在這些突變中，lulei株與zhanxing株共有7個(gè)相同的氨基酸突變。 結(jié)論：對(duì)三株致GBS空腸彎曲菌wla基因簇的序列測(cè)定和進(jìn)化分析得到菌株的序列特征及與其他菌株的親緣性。以基因簇中的單個(gè)基因?yàn)閱挝粯?gòu)建進(jìn)化樹的結(jié)果顯示，本地菌株在wlaK、wlaM以及其它一些基因中存在聚類現(xiàn)象，這些基因中可能具有本地菌株基因特征。與NCTC11168的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)三株菌的wla基因簇存在多處突變，導(dǎo)致