自噬抑制對EPCs在靜脈血栓機(jī)化再通中的作用及影響.pdf

1、目的：體外誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs），應(yīng)用大自噬抑制劑3-MA（3-甲基腺嘌呤）干預(yù)后移植到大鼠深靜脈血栓模型體內(nèi)，探討干預(yù)后的EPCs在血栓機(jī)化再通中的作用，為深靜脈血栓的治療提供一種新的思路和實驗依據(jù)。
　　方法：1. Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠的骨髓單個核細(xì)胞（bone marrow-derived mononuclear cells，BMMNCs）

2、，內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM-2MV）體外誘導(dǎo)分化為 EPCs并進(jìn)行鑒定。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、內(nèi)皮細(xì)胞系列標(biāo)志 VEGFR-2、vwF免疫組化，祖細(xì)胞標(biāo)志CD133、CD34免疫熒光技術(shù)動態(tài)鑒定。MTT比色法觀察其增值能力。
　　2.血栓模型建立：采用縮窄腎下段下腔靜脈結(jié)合三氯化鐵浸潤破壞血管內(nèi)膜方法建立大鼠深靜脈血栓模型，并飼養(yǎng)至10d。動物隨機(jī)分四組，經(jīng)大鼠股靜脈穿刺注射1ml移植液體。A組(n=10)：空白對照組，注射生理鹽水；B

3、組（n=10）EPCs移植組，移植含有106個EPCs的細(xì)胞懸液；C組(n=10)：注射1ml3-MA稀釋液（5mmol/l）；D組(n=10)：移植1ml經(jīng)3-MA稀釋液（5mmol/l）處理后的EPCs的細(xì)胞懸液。3．移植后分四個時間段（0天、7天、14天、28天）取出血栓段下腔靜脈及血栓，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、HE染色及電鏡檢測各組血栓中新生血管及機(jī)化再通的情況。4．采用SPSSl7．0軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：1.新分離的骨

4、髓單個核細(xì)胞(BMMNCs)呈圓形，大小不一，第3天左右細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁，形態(tài)呈梭形、卵圓形、紡錘形、三角形或不規(guī)則形，一周左右可見細(xì)胞集落、細(xì)胞呈線狀排列，第10天左右細(xì)胞呈典型鵝卵石樣外觀。細(xì)胞生長曲線呈―S‖形， EPCs在培養(yǎng)的7~13天時增殖較快，14天后進(jìn)入平臺期，生長曲線呈典型―s’’形外觀。貼壁細(xì)胞的CD34、VEGF、vWF、CD133均表達(dá)陽性。
　　2.體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)了大鼠骨髓源性EPCs；vWF免疫組化顯