2型糖尿病及其微血管并發(fā)癥患者血清microRNA表達(dá)譜篩選及臨床價(jià)值研究.pdf

1、目的:篩選2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM）及其微血管并發(fā)癥(Type2 diabetes mellitus microvascular complications，T2DMC)患者特異變化血清微小核糖核酸(microRNA，miRNA)表達(dá)譜，評(píng)價(jià)其對(duì)T2DM及T2DMC的診斷、鑒別診斷和病情監(jiān)控臨床價(jià)值。
　　方法:收集2013年9月～2014年5月間南京軍區(qū)總院內(nèi)分泌科收治的新發(fā)或一個(gè)月內(nèi)

2、未經(jīng)任何治療的T2DM及T2DMC各87例，同時(shí)收集同期在醫(yī)院體檢中心年齡、性別完全匹配的健康體檢者87例做為正常對(duì)照。首先采用高通量、高靈敏度的低密度芯片技術(shù)（TaqMan Low Density Array, TLDA）對(duì)T2DM、T2DMC及健康對(duì)照各25例樣本分別組成的混合血清中768種miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，初篩T2DM和T2DMC特異變化的一組血清miRNA;然后運(yùn)用準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitativ

3、e real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)對(duì)初篩miRNA在TLDA所使用的同一批樣本中進(jìn)行復(fù)篩（復(fù)篩組）;進(jìn)一步運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在另外三組T2DM、T2DMC和健康對(duì)照各62例樣本中對(duì)復(fù)篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證（驗(yàn)證組），篩選T2DM及T2DMC患者血清中穩(wěn)定變化的一組miRNA。同時(shí)，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)

4、定全部患者及對(duì)照血清樣本中氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化脂蛋白(a)[ox-Lp(a)]、β2糖蛋白氧化低密度脂蛋白復(fù)合物(β2-GPI-ox-LDL)和β2糖蛋白脂蛋白(a)復(fù)合物[β2-GPI-Lp(a)]的水平，運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析和邏輯回歸分析患者特異變化血清miRNA與上述脂蛋白、臨床指標(biāo)相關(guān)性及是否為T(mén)2DM及T2DMC獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果:TLDA結(jié)果顯示，T2DM及T2DMC患者血清miRNA

5、表達(dá)譜與健康對(duì)照相比具有明顯差異，53種miRNA在T2DM及T2DMC患者血清中較對(duì)照組表達(dá)上升，117種miRNA在患者表達(dá)下降。結(jié)合TLDA初篩及文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果，我們選取了12種miRNA在復(fù)篩組樣本中進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)8種miRNA，包括miR-571、miR-661、miR-1303、miR-152、miR-1323、miR-892b、miR-770-5p和miR-886-3p水平在兩組患者血清中顯著上升，其中在T2DMC患者中變化

6、更為顯著（變化倍數(shù)＞2，P＜0.05）;8種miRNA在驗(yàn)證組中變化趨勢(shì)與復(fù)篩組一致（變化倍數(shù)＞2，P＜0.05）;ROC曲線分析顯示，8種血清miRNA對(duì)T2DM診斷的ROC曲線下面積(AUC)在0.774～0.877之間，對(duì)T2DMC診斷的ROC曲線下面積在0.823～0.946之間，對(duì)T2DM和T2DMC鑒別診斷的ROC曲線下面積在0.611～0.675之間。根據(jù)選定的cutoff值，8種血清miRNA對(duì)T2DM診斷的靈敏性和特異

7、性分別在68.2％～88.1％和63.0％～84.5％之間;對(duì)T2DMC診斷的靈敏性和特異性分別在64.8％～84.7％和80.6％～98.6％之間;進(jìn)一步分析上述miRNA的鑒別診斷價(jià)值顯示，3種miRNA對(duì)T2DM和T2DMC的鑒別診斷具一定臨床價(jià)值，其AUC、靈敏性和特異性分別為:miR-886-3p(AUC=0.675，靈敏性=0.651，特異性=0.628)、miR-892b（AUC=0.639，靈敏性=0.662，特異性=0

8、.622）和miR-571(AUC=0.611，靈敏性=0.603，特異性=0.608)。ELISA結(jié)果顯示，T2DM和T2DMC患者ox-LDL、ox-Lp(a)、β2-GPI-ox-LDL、β2-GPI-Lp(a)水平亦顯著高于健康對(duì)照組（P均＜0.05）。Spearman秩相關(guān)分析顯示，T2DM和T2DMC患者變化的8種血清miRNA與空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)PG)、ox-LDL、ox-Lp(a)呈

9、顯著正相關(guān)（P均＜0.05）。單因素邏輯回歸分析顯示，8種血清miRNA、氧化脂蛋白及其復(fù)合物均為預(yù)測(cè)T2DM和T2DMC患者發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;進(jìn)一步多因素分析結(jié)果顯示，在排除性別、年齡等影響因素后，miR-770、miR-661和甘油三酯仍是兩組患者獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:8種血清包括miR-571、miR-661、miR-1303、miR-152、miR-1323、miR-892b、miR-770-5p和miR-886-3