miRNA-210在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化中的作用及意義.pdf

1、背景
　　miRNA（microRNA）是由約22個(gè)核苷酸組成的單鏈小RNA，并在真核生物細(xì)胞中廣泛存在，miRNA基因約占整個(gè)基因組的1％。近些年來(lái)的各項(xiàng)研究表明miRNA一個(gè)非常龐大的家族，存在于是在植物、線蟲、果蠅、小鼠、大鼠和人等多個(gè)物種中。miRNA對(duì)各種進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控是通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平與其靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致mRNA的翻譯、翻譯抑制以及降解。一個(gè)異常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由miRNA與靶mRNA分子組成，參與包括細(xì)胞繁

2、殖與凋亡，細(xì)胞分化與發(fā)育，以及逆境應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可具有多向分化潛能，能分化成多種類型的結(jié)締組織，如骨組織、軟骨組織、骨骼肌組織、肌腱組織、韌帶組織、真皮組織、脂肪組織，也可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）易于在體外擴(kuò)增，來(lái)源又比較廣泛，是目前組織工程中一種重要的種子細(xì)胞。
　　各種生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織分化以及疾病發(fā)生等miRNA均參

3、與調(diào)控，其同時(shí)它眾多生物體發(fā)育和行為等的變化miRNA同樣起著決定作用。在干細(xì)胞增殖以及分化中miRNA的作用及意義這些年來(lái)開(kāi)始受到關(guān)注。在許多種干細(xì)胞中miRNA都有表達(dá)，并且通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，對(duì)干細(xì)胞的保持自我更新以及多向分化等功能發(fā)揮作用。
　　目的
　　通過(guò)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞中miRNA-210基因的表達(dá)高低，推測(cè)miRNA-210的功能，證明miRNA-210調(diào)控人骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。從而，進(jìn)一步驗(yàn)證了在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化中miRNA的重要作用及意義。
　　方法
　　1．對(duì)收集的標(biāo)本中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用全骨髓貼壁法（貼壁篩選法）、密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定是通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)并對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD29、CD44、CD34、CD45）采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)來(lái)完成。
　　2．采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典的方法：β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)人M

5、SCs向成骨細(xì)胞方向分化。誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞的鑒定是堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素紅S法染色來(lái)對(duì)比完成。
　　3．利用Realtime-PCR觀察對(duì)比miRNA-210在人MSCs與其誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞的差異。
　　4．采用將miRNA-210模擬物及阻遏物轉(zhuǎn)染至人MSCs中14天后，通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素紅S法染色對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果
　　1．經(jīng)全骨髓貼壁法（貼壁篩選法）及密度梯度離心法

6、分離貼壁培養(yǎng)所得到的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果為：細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45為陰性，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44為陽(yáng)性，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本特征。
　　2．采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典的方法：β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)14天后得到的細(xì)胞：堿性磷酸酶染色（ALP）染色及茜素紅S法染色均為陽(yáng)性，符合成骨細(xì)胞的特征。
　　3．利用Realtime-PCR觀察與對(duì)比miRNA-210在人MSCs與其誘導(dǎo)成的成

7、骨細(xì)胞的差異。表明miRNA-210在人MSCs中高表達(dá)，在誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞低表達(dá)。
　　4．將miRNA-210模擬物（miRNA-210mimics）及阻遏物（miRNA-210inhibitors）轉(zhuǎn)染至人MSCs中14天后，通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素紅S法染色對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)染miRNA-210模擬物的細(xì)胞能夠保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本特征；而轉(zhuǎn)染miRNA-210阻遏物的細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素