環(huán)境嗜肺軍團菌在巨噬細胞內(nèi)的生長特征及致病機制研究.pdf

1、第一部分環(huán)境嗜肺軍團菌在小鼠巨噬細胞內(nèi)的生長特征
　　[目的]嗜肺軍團菌是一種胞內(nèi)生長菌，可引起爆發(fā)性、致死性肺炎，水體環(huán)境中定植的嗜肺軍團菌是人軍團菌病的主要感染源。本研究采用醫(yī)院供水系統(tǒng)中分離的菌株，研究環(huán)境嗜肺軍團菌(Environmental Legionella pneumophila，LPE)在宿主巨噬細胞內(nèi)的生長特征及機制。[方法]以臨床分離的嗜肺軍團菌費城株的衍生菌株JR32作為對照菌株，通過細菌定量培養(yǎng)觀察LPE

2、在A/J小鼠骨髓巨噬細胞(Bone marrow derived macrophage from A/J mouse，BMDMA/J)，人巨噬細胞U937和阿米巴宿主盤基網(wǎng)柄菌胞內(nèi)的生長情況。隨后通過對LPE509中Dot/Icm IVB型分泌系統(tǒng)(Type IVB Secretion System，T4BSS)的組成和β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)位實驗檢測LPE509運輸效應(yīng)蛋白至宿主胞漿的功能。最后通過對宿主蛋白Rab1，LAMP-1和細菌囊泡的

3、熒光染色研究感染早期宿主蛋白對LPE509囊泡的錨定及其在胞內(nèi)的發(fā)展。[結(jié)果](1) LPE509在人巨噬細胞U937和盤基網(wǎng)柄菌內(nèi)可有效生長，但在BMDMM內(nèi)的生長受限。敲除dotA基因可限制LPE509在U937細胞中的生長，但不影響其在BMDMA/J中的生長。(2)基因測序顯示結(jié)果LPE509具有由27個基因組成的完整的T4BSS;β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)位實驗顯示LPE509對效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運功能與JR32相似(1pg1171:76.3±3

4、.9＜ vs70.5±7.8，P＞0.05;lpg0796:56.9±4.9＜ vs60±6.0＜，P＞0.05)。(3)熒光染色顯示LPE509感染小鼠巨噬細胞后1h，2h和6h對宿主蛋白LAMP-1和Rab1的招募作用與JR32相比無明顯差別(P＞0.05)。(4) LPE509感染BMDMA/J后14 h，發(fā)展為大型囊泡的比率顯著小于JR32(18.2±2.0％ vs66.0±5.2＜，P＜0.001)。(5) LPE509感染B

5、MDMA/J后14h蓋玻片上細胞數(shù)量較感染前顯著減少，其比率大于由JR32感染引起的細胞數(shù)量減少(44.9±14.5％ vs9.4±16.3＜，P＜0.05)。(6) LPE509感染BMDMA/J后5h，囊泡破壞比率顯著高于JR32感染后囊泡破壞的比率(60.0±11.7％ vs15.5±0.06＜，P＜0.001)。[結(jié)論]與既往研究的臨床嗜肺軍團菌不同，LPE509具有宿主特異性的生長限制。其機制可能與宿主細胞對細菌囊泡的破壞及L

6、PE509感染引起的造成宿主細胞的急劇減少有關(guān)。
　　第二部分環(huán)境嗜肺軍團菌感染導致小鼠巨噬細胞焦亡及其機制
　　[目的]研究環(huán)境嗜肺軍團菌在小鼠巨噬細胞胞內(nèi)生長受限原因及可能的機制。[方法]本研究以JR32作為對照菌株，通過Hoechst/PI雙核酸染色技術(shù)，LDH釋放實驗和TUNEL染色確定LPE509感染BMDMA/J后發(fā)生的細胞死亡形式，并通過對感染細胞上清液中HMGB1和IL-1β的檢測了解在細胞死亡過程中伴隨的炎

7、癥因子釋放。隨后使用敲除flaA基因的LPE509感染小鼠巨噬細胞并檢測由此引起的細胞死亡以確定細菌鞭毛蛋白在導致細胞死亡中的作用。通過對caspase-1/11-/-小鼠巨噬細胞感染實驗確定caspase1和caspase11在LPE509導致的細胞死亡中的作用。最后，使用EMS隨機突變方法篩選出一個LPE509的突變子，并初步確定了可能影響LPE509胞內(nèi)生長的細菌毒力因子。[結(jié)果](1)LPE509感染導致的細胞PI染色陽性率，L

8、DH釋放及TUNEL染色陽性率均顯著高于JR32(PI:44.2±2.0＜ vs5.0±1.4＜,P＜0.001;LDH:2 h16.3±2.7＜ vs1.1±1.0＜,P＜0.001,4 h34.2±5.3＜ vs12.9±1.3＜,P＜0.01;TUNEL:42.4±4.8＜ vs17.9±1.3＜,P＜0.01)。(2) LPE509感染小鼠巨噬細胞后可引起HMGB1和IL-1β的釋放，而LPE509△dotA感染后未檢測到HMG

9、B1和IL-1△的釋放。(3) LPE509△flaA菌株感染A/J小鼠和C57BL/6小鼠巨噬細胞后均不能在胞內(nèi)生長，并且感染后細胞PI染色陽性和TUNEL染色陽性率仍顯著高于JR32(PI:37.2±5.2＜ vs5.0±1.4＜，P＜0.001;TUNEL:38.2±2.8＜ vs17.9±1.3＜,P＜0.001)。(4) LPE509和LPE509△flaA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬細胞后仍不能在胞內(nèi)生長，且L

10、PE509△flaA感染后導致的LDH釋放顯著高于JR32△flaA(63.4±5.1％ vs12.5±1.9＜，P＜0.001)。LPE509和LPE509△flaA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬細胞后所引起的IL-1β釋放較感染C57BL/6小鼠的IL-1β釋放減少。(5)使用EMS隨機突變，我們篩選到一株LPE509突變子可在BMDMA/J進行增殖?；蚪M測序比對后發(fā)現(xiàn)了在蛋白編碼基因lvrA，lpg1594, lpg