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文檔簡介
1、脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)后,膠質(zhì)瘢痕(glialscar)的形成是慢性SCI的特征之一,并且是脊髓損傷后神經(jīng)再生障礙的重要原因,脊髓損傷如脊髓挫傷后反應(yīng)性膠質(zhì)化(reactivegliosis),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后慢性期的主要病變之一,這種反應(yīng)性膠質(zhì)化,將壞死組織與脊髓隔離,并使前者液化形成囊腔,一方面阻止脊髓的繼發(fā)性損害,另一方面也阻礙了軸突再生。如何在移植治療中判斷切除膠質(zhì)瘢痕的時機與范圍,是神經(jīng)外科的
2、難題之一。以往的研究對膠質(zhì)瘢痕的空間分布特征缺乏研究,目前也無切除膠質(zhì)瘢痕的適宜方法。本研究擬制備打擊傷SCI模型,觀察SCI的影像學(xué)與病理學(xué)表現(xiàn)及大鼠慢性SCI膠質(zhì)瘢痕的時間與空間分布,希望能發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕分布規(guī)律,為徹底去除膠質(zhì)瘢痕提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。 材料與方法 1.采用犬為脊髓打擊傷模型的損傷能量為30g×15cm,重點對SCI后組織學(xué)與影像學(xué)變化對比觀察,觀察SCI影像學(xué)變化的病理基礎(chǔ);采用SD大鼠為脊髓打擊傷模型的
3、損傷能量為30g×5cm,以組織學(xué)、神經(jīng)運動功能評分、誘發(fā)電位測試、免疫組織化學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)雙標記、BDA順行神經(jīng)纖維示蹤、TMR與HRP逆行神經(jīng)纖維示蹤等方法進行觀察,且大鼠所有標本均采用恒冷箱矢狀縱行切片,每個脊髓標本切片100張,脊髓全部標本10套均進行不同染色觀察,每張載玻上每兩張切片間隔200μm,每張切片均能觀察到損傷區(qū)及損傷區(qū)兩端5mm內(nèi)殘留組織,經(jīng)普通光學(xué)微鏡及熒光顯微鏡下觀察并進行圖像拼接,觀察損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕分布
4、的形成時間與空間分布規(guī)律,膠質(zhì)瘢痕厚度及膠質(zhì)瘢痕區(qū)軸突與星形膠質(zhì)細胞的空間關(guān)系。 2.采用免疫組織化學(xué)染色觀察SCI后神經(jīng)干細胞標志物nestin與軸突生長抑制因子nogo在SCI后不同時間、不同部位的表達、分布,并分別與NF免疫熒光雙標觀察SCI后損傷區(qū)范圍神經(jīng)再生內(nèi)在修復(fù)能力變化規(guī)律,軸突生長抑制因子nogo在損傷區(qū)分布及其與軸突再生的相互關(guān)系。 3.脊髓損傷大鼠在傷后8周采用BDA順行神經(jīng)纖維示蹤、TMR與HRP逆
5、行神經(jīng)纖維示蹤結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)、NF與GFAP熒光雙標方法,在矢狀縱切片不同部位觀察上行及下行軸突再生情況、膠質(zhì)瘢痕對軸突再生的影響。 結(jié)果 1.犬脊髓打擊傷后4周,MRI影像上出現(xiàn)邊界清晰的高信號影提示囊腔的形成,病理學(xué)觀察證實了脊髓損傷區(qū)囊腔的形成。慢性期運動與感覺誘發(fā)電位的潛伏期均較正常犬明顯延長并在傷后4周進入恢復(fù)平臺期,提示脊髓損傷后4-8周損傷進入慢性期,可能是慢性SCI修復(fù)的時機;病理學(xué)與MRI對比觀察
6、,提示T2WI影像對于囊腔形態(tài)反映的更為準確,提示T2WI影像對于術(shù)前判斷損傷區(qū)囊腔形態(tài)及定位的重要性。 2.大鼠脊髓打擊模型在傷后BBB評分明顯下降,以后逐漸恢復(fù),在4周時達到平臺期;運動與感覺誘發(fā)電位的潛伏期在傷后明顯延長,以后逐漸恢復(fù),在4周后相對穩(wěn)定;病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在2周開始形成囊腔,4周時形成的囊腔較為穩(wěn)定,囊腔位于脊髓中央,呈不規(guī)則長橢園形,長軸與脊髓縱軸一致,提示大鼠脊髓打擊傷模型傷后4周進入慢性期。 3.
7、經(jīng)組織學(xué)矢狀縱行切片的全面觀察,發(fā)現(xiàn)損傷后出血的脊髓長度遠超過直接打擊挫傷的長度,隨后形成的囊腔長度也遠遠地超過打擊桿直徑直接打擊的脊髓長度,損傷區(qū)長度:打擊桿直徑>8:1,提示早期干預(yù)減輕繼發(fā)性損害的時機與早期干預(yù)縮短損傷區(qū)長度的重要性。 4.在膠質(zhì)瘢痕區(qū),發(fā)現(xiàn)nogo表達與膠質(zhì)瘢痕的形態(tài)一致,提示膠質(zhì)瘢痕不僅為軸突生長的物理屏障,而且nogo的化學(xué)抑制作用也是構(gòu)成膠質(zhì)瘢痕的化學(xué)屏障的重要因素之一;SCI后1周損傷區(qū)附近nes
8、tin表達開始增加,傷后2周達高峰,并有少量神經(jīng)元表達nestin,傷后4周明顯下降,表明內(nèi)源性再生發(fā)生的時間與規(guī)律,提示提高內(nèi)源性再生能力的干預(yù)時機。 5.免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),慢性脊髓損傷的囊腔周圍GFAP陽性表達的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞肥大增生、突起豐富,是構(gòu)成膠質(zhì)瘢痕的主要成分并作為膠質(zhì)瘢痕邊界的標志;傷后2周,在損傷區(qū)周圍可見有陽性表達的星形膠質(zhì)細胞,NF表達可以明確地觀察到損傷后軸突分布的情況。BDA順行示蹤、TMR與H
9、RP逆行示蹤觀察到軸突走行于膠質(zhì)瘢痕外,未到達囊腔內(nèi)或囊腔邊緣,僅有部分軸突伸入到膠質(zhì)瘢痕一定的深度,但未見有軸突穿透膠質(zhì)瘢痕到達囊腔內(nèi)。提示膠質(zhì)瘢痕對于軸突再生的機械性物理屏障作用。 6.膠質(zhì)瘢痕形成時間與空間分布:損傷后4-8周,損傷區(qū)囊腔外形成了膠質(zhì)瘢痕,膠質(zhì)瘢痕分布于囊腔周圍,形成了囊腔壁;經(jīng)免疫熒光雙標觀察發(fā)現(xiàn),囊腔的頭端和尾端膠質(zhì)瘢痕厚度與側(cè)壁的膠質(zhì)瘢痕厚度有一定差別,頭尾端膠質(zhì)瘢痕厚度為107.00±20.12μm
10、,側(cè)壁膠質(zhì)瘢痕厚度為69.92±24.37μm,提示去除膠質(zhì)瘢痕的部位與范圍。 結(jié)論 1.采用組織學(xué)觀察、神經(jīng)功能評分、影像學(xué)、免疫組織化學(xué)及免疫熒光組織化學(xué)雙標記法、BDA順行神經(jīng)纖維示蹤、TMR與HRP逆行神經(jīng)纖維示蹤結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)方法,觀察到犬和大鼠脊髓損傷打擊傷方法制備的脊髓損傷動物模型,成功地反映了膠質(zhì)瘢痕形成的病理規(guī)律與影像學(xué)特征,對于脊髓損傷后研究膠質(zhì)瘢痕有重要的應(yīng)用價值。 2.通過觀察神經(jīng)干
11、細胞標志物nestin在脊髓損傷后表達規(guī)律,發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后機體內(nèi)源性再生能力出現(xiàn)與消退的規(guī)律,為治療中提高內(nèi)源性再生能力的干預(yù)時機提供了依據(jù);通過對軸突生長抑制因子nogo在損傷區(qū)分布規(guī)律及其與膠質(zhì)瘢痕、軸突的關(guān)系的觀察,表明在膠質(zhì)瘢痕抑制軸突生長的機械性、物理性屏障和化學(xué)性屏障作用中,nogo是組成化學(xué)性屏障的重要因素之一,進一步證明去除膠質(zhì)瘢痕的必要性。 3.通過組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)雙標記法,觀察到脊髓損傷
12、后損傷區(qū)組織液化壞死,在傷后4周形成與脊髓長軸一致的長橢園形囊腔,同時反應(yīng)性膠質(zhì)化形成的肥大、增生的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞,在囊腔周圍形成致密的膠質(zhì)瘢痕,將其與殘留組織分隔,并對膠質(zhì)瘢痕厚度進行測量,對于準確判斷切除膠質(zhì)瘢痕的部位與范圍提供了實驗依據(jù)?;诩顾钃p傷后,損傷區(qū)囊腔與反應(yīng)性膠質(zhì)化的形成規(guī)律與分布特征,提出廣義的膠質(zhì)瘢痕應(yīng)該包括兩部分:(1)囊腔,由于損傷后繼發(fā)性損害形成的壞死細胞液化而成,位于脊髓中央;(2)反應(yīng)性膠質(zhì)化形成的囊
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