姜黃素對(duì)大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、脊髓損傷(spinAlcord injury，SCI)發(fā)生率高，危害嚴(yán)重。迄今為止還沒(méi)有針對(duì)脊髓損傷確定性的治療方法，其重要原因是損傷機(jī)制不十分清楚。
　　 中樞神經(jīng)損傷(CentrAlnervous system，CNS)后有意義的神經(jīng)束再生失敗的重要原因是由反應(yīng)性膠質(zhì)化導(dǎo)致的膠質(zhì)瘢痕的形成。反應(yīng)性膠質(zhì)化(gliosis)或稱反應(yīng)性膠質(zhì)增生，是一個(gè)復(fù)雜修復(fù)反應(yīng)，主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷后被激活，以GFAP、Vim為標(biāo)志的中間

2、絲蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞肥大增生，最終形成膠質(zhì)瘢痕。損傷部位幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞(尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞)都可以分泌抑制性細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分CSPGs。反應(yīng)性膠質(zhì)化所構(gòu)成的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以作為物理性屏障在空間上封閉生長(zhǎng)錐的前進(jìn)；而CSPGs 則成為抑制軸突出芽的化學(xué)性屏障。故而，膠質(zhì)瘢痕形成被視為抑制軸突再生最主要的障礙。如何有效抑制膠質(zhì)瘢痕形成，具有重要意義。甲基強(qiáng)的松龍?jiān)粡V泛應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷，近來(lái)因其有效性和不良反應(yīng)受到質(zhì)疑。

3、r>　　 姜黃提取自姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃(Curcuma Longa L.)干燥梗莖中，因其具有多種藥理學(xué)特性如抗氧化、抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗真菌而且安全，無(wú)毒被廣泛應(yīng)用于癌癥、代謝性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病、糖尿病等的臨床治療。
　　 此外，由于姜黃素具有顯著的安全性并具有多向神經(jīng)保護(hù)潛能而被應(yīng)用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在包括阿爾茨海默病，遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙，嚴(yán)重抑郁，癲癇和其他相關(guān)的神經(jīng)變性和神經(jīng)精神疾病的實(shí)驗(yàn)

4、研究中被證實(shí)有效。
　　 由于脊髓損傷是突發(fā)機(jī)械性創(chuàng)傷導(dǎo)致的出血、組織壞死，原發(fā)損傷及繼發(fā)損傷多種相關(guān)的病理生理改變恰好與姜黃素的抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗膠質(zhì)細(xì)胞等特性相契合。因此，我們將姜黃素作為干預(yù)措施，觀察其對(duì)預(yù)防和治療脊髓損傷的功效。
　　 通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓損傷模型，給予姜黃素預(yù)處理、甲基強(qiáng)的松龍干預(yù)治療及單純脊髓損傷大鼠作對(duì)比，通過(guò)受損脊髓組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、運(yùn)動(dòng)學(xué)功能評(píng)分評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)SCI的治療

5、作用，采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、免疫蛋白印跡方法檢測(cè)姜黃素對(duì)于損傷后GFAP、Vim、CSPGs表達(dá)的影響，Elisa 法檢測(cè)脊髓損傷后早期前炎癥細(xì)胞因子的變化觀察了不同濃度姜黃素對(duì)大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的作用，對(duì)GFAP、Vim和CSPGs表達(dá)的影響和炎癥反應(yīng)的作用，初步探討了姜黃素對(duì)大鼠脊髓損傷的影響及其可能作用機(jī)制以期為臨床急性脊髓損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的
　　 通過(guò)研究姜黃素對(duì)大鼠SCI后脊

6、髓組織病理改變、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)功能恢復(fù)情況、早期炎癥反應(yīng)的作用，探討姜黃素對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法
　　 構(gòu)建大鼠模型：288只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組①單純損傷組②姜黃素預(yù)處理組(術(shù)前30min，300mg/kg，I.p.)③-⑤姜黃素治療(大300mg/kg、中100mg/kg、小劑量30mg/kg，I.p.)組和⑥甲強(qiáng)龍治療組(30mg/kg，I.v.)。以50g 力的動(dòng)脈瘤夾鉗夾胸

7、T9-10段脊髓1分鐘制造脊髓鉗夾損傷模型并按計(jì)劃給藥。傷后1d，1-8w 每周行Basso BeattieBresnahan(BBB)評(píng)分及斜板試驗(yàn)，術(shù)后2w、8w大鼠，HE 染色觀察脊髓組織病理變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR 檢測(cè)各組GFAP mRNA、Vim mRNA 相對(duì)含量的變化，免疫組化法和Western blot 檢測(cè)GFAP、CSPGs蛋白的表達(dá)差異。Elisa 法檢測(cè)SCI后1h、3h、6h、12h、24h、7

8、2h 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κ B、TGF-β1、TGF-β2、SOX-9表達(dá)變化。
　　 結(jié)果
　　 建立了大鼠脊髓鉗夾損傷模型，以50g 力的動(dòng)脈瘤夾鉗夾T9-10胸段脊髓1min造模，SCI后大鼠呈現(xiàn)典型的截癱癥狀；
　　 1、病理學(xué)
　　 大體標(biāo)本觀察到SCI后8w，姜黃素治療各組損傷處脊髓縮窄、粘連減輕。
　　 HE 染色顯示SCI后2w，用姜

9、黃素治療后，相比于單純損傷組和甲強(qiáng)龍組，脊髓形態(tài)較為完整，神經(jīng)元固縮、溶解、壞死減輕，炎癥反應(yīng)較輕，姜黃素預(yù)處理組組織損害輕于甲強(qiáng)龍組；SCI后8w，用姜黃素治療后，脊髓組織結(jié)構(gòu)較為清晰，更多正常的神經(jīng)元，膠質(zhì)瘢痕較規(guī)則，組織空洞小于單純損傷組(P<0.05)，姜黃素預(yù)處理組也較單純損傷組空洞范圍小。提示姜黃素可以減少脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成及縮小空洞，有助于再生的軸突穿越膠質(zhì)瘢痕到達(dá)損傷區(qū)的遠(yuǎn)側(cè)端，建立新的神經(jīng)通路和功能聯(lián)系。
　

10、　 2、免疫組織化學(xué)染色顯示SCI后2w、8w 姜黃素治療組、姜黃素預(yù)處理組、甲強(qiáng)龍組損傷中心區(qū)邊緣GFAP、CSPGs 染色均不同程度減弱，表達(dá)降低，瘢痕、空洞縮小，其中，姜黃素治療組隨劑量增大，抑制效果越趨明顯，而姜黃素預(yù)處理組則優(yōu)于甲強(qiáng)龍組。說(shuō)明姜黃素可以抑制脊髓損傷后GFAP、CSPGs表達(dá)，削弱膠質(zhì)瘢痕、囊腔空洞及其中的抑制性因子的物理、化學(xué)屏障作用，有利于軸突的再生。
　　 3、RT-PCR 結(jié)果顯示姜黃素治療、姜

11、黃素預(yù)處理以及甲強(qiáng)龍治療脊髓損傷后2w、8w大鼠脊髓損傷段GFAP mRNA、Vim mRNA表達(dá)相比于單純損傷組均有所降低。而姜黃素治療組中隨劑量增加療效增強(qiáng)，姜黃素預(yù)處理組比甲強(qiáng)龍組抑制作用明顯。說(shuō)明脊髓損傷后應(yīng)用姜黃素治療能抑制損傷區(qū)周?chē)顾杞M織GFAP mRNA、Vim mRNA表達(dá)的增加。
　　 4、Western blot 檢測(cè)均提示2w、8w 各組GFAP和CSPGs蛋白的表達(dá)上調(diào)，姜黃素治療后的表達(dá)明顯弱于單純損

12、傷組大鼠，大劑量組最明顯，姜黃素預(yù)處理組也可抑制GFAP和CSPGs的升高。
　　 5、行為學(xué)
　　 后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯示脊髓損傷后完全性后肢癱瘓的各組大鼠逐漸恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能，姜黃素各組2、8w的行為功能均顯著優(yōu)于單純損傷組和甲強(qiáng)龍治療組，大劑量組效果最好(P<0.05)，姜黃素預(yù)處理組在術(shù)后4w 起也較單純損傷組表現(xiàn)出更好的行為學(xué)功能。
　　 6、Elisa 結(jié)果顯示脊髓損傷后組織中檢測(cè)的各前炎癥細(xì)胞因子在傷后1h

13、開(kāi)始升高，至12h 達(dá)峰值，而后逐漸減弱，持續(xù)降低至損傷后72h(觀察最后時(shí)間點(diǎn))，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)姜黃素大劑量組、中劑量組表達(dá)均低于單純損傷組，而高于甲強(qiáng)龍組。姜黃素預(yù)處理組在對(duì)各前炎癥細(xì)胞因子的檢測(cè)中未表現(xiàn)出與其他組有明顯的含量差別。提示大、中劑量姜黃素能不同程度的抑制SCI 急性期各種炎癥因子的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1、姜黃素能夠促進(jìn)SCI后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；可以抑制損傷部位中間絲蛋白標(biāo)志物GFAP、Vim的生

14、成，并抑制性細(xì)胞外基質(zhì)成分CSPGs的表達(dá)，減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化，減少膠質(zhì)瘢痕形成及縮小空洞，削弱了因膠質(zhì)瘢痕形成給軸突再生造成的物理、化學(xué)屏障，姜黃素可以抑制各組前炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、NF-κ B、TNF-α、SOX-9、TGF-β1及TGF-β2)的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，改善SCI 傷后局部的微環(huán)境，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用；這種保護(hù)作用可能是與減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān)。
　　 2、姜黃素