對(duì)甜菜夜蛾高毒力的蘇云金芽胞桿菌D1-23菌株的選育及其發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、本課題以篩選和選育寬殺蟲譜的蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)為目的,獲得對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲高毒力的蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種(B.thuringiensis subsp.kurstaki)菌株D1-23。以提高殺蟲晶體蛋白(ICPs)和雙效菌素(Zwittermicin A)產(chǎn)量為目標(biāo),優(yōu)化突變株D1-23液體發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件,并對(duì)其補(bǔ)料發(fā)酵工藝進(jìn)行探討。
　　 以甜菜夜蛾為供試?yán)ハx,以草生歐文

2、氏菌LS005為指示菌,采用生物測(cè)定、瓊脂平板擴(kuò)散法和SDS-PAGE法,從本實(shí)驗(yàn)室保存的200株Bt中,篩選出一株對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲具有較高毒力的菌株BMB005,該菌株能夠產(chǎn)Zwittermicin A。并建立了高效選育對(duì)甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株的模型,通過該模型選育出一株不僅高產(chǎn)Zwittermicin A,而且對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲均具有高毒力的菌株D1-23,生物測(cè)定結(jié)果表明,和出發(fā)菌株BMB005相比,殺蟲毒力分別提高了11

3、5.4％和25.9％。
　　 研究了BMB005和D1-23菌株發(fā)酵過程中菌體的生長(zhǎng)曲線和Zwittermicin A產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線之間的關(guān)系,結(jié)果表明Zwittermicin A是Bt產(chǎn)生的與生長(zhǎng)相偶聯(lián)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,它在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期開始產(chǎn)生,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大量產(chǎn)生,穩(wěn)定期前期產(chǎn)量達(dá)到最高,以后趨于穩(wěn)定,但仍有少量合成。
　　 通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法首次綜合考慮培養(yǎng)基

4、成分和培養(yǎng)條件對(duì)ICPs和Zwittermicin A產(chǎn)量的影響,得到了D1-23菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基組成為:玉米淀粉35 g/L,N135 g/L,N215 g/L,N34.4 g/L,N42.1 g/L,N50.625g/L,KH2PO42g/L,MgSO4·7H2O0.7g/L,CaCO32g/L。最優(yōu)培養(yǎng)條件為:接種量為1％,菌齡6 h,裝液量為20 mL/500 mL,溫度28～30℃,消前pH值8.0。在3

5、L發(fā)酵罐中發(fā)酵D1-23菌株,優(yōu)化后的發(fā)酵工藝與原始發(fā)酵工藝相比,得到的ICPs和Zwittermicin A產(chǎn)量分別提高了28.87％和61.22％。對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲的LC50分別為0.251μL/mL,和0.105μL/mL,殺蟲毒力分別提高了23.90％和40％。
　　 本研究首次考察了補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)ICPs、Zwittermicin A產(chǎn)量和芽胞數(shù)的綜合影響,探討了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期補(bǔ)加不同濃度的葡萄糖、液化玉米淀粉和大豆蛋白

6、胨,在穩(wěn)定期前期補(bǔ)加不同濃度的乙酸、NaNO3對(duì)ICPs、Zwittermicin A產(chǎn)量和芽胞數(shù)的影響。
　　 并運(yùn)用響應(yīng)面分析法探討在對(duì)數(shù)期末期補(bǔ)加大豆蛋白胨和液化玉米淀粉對(duì)ICPs、Zwittermicin A產(chǎn)量以及芽胞數(shù)的影響。并得到最佳的搖瓶補(bǔ)料工藝為:在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期同時(shí)補(bǔ)加3.89 g/L大豆蛋白胨和3.24g/L液化玉米淀粉。在3L發(fā)酵罐中發(fā)酵D1-23菌株,與對(duì)照(不補(bǔ)料)相比,優(yōu)化補(bǔ)料工藝發(fā)酵得到的ICPs