DNA測序與線性反向探針雜交法檢測HBVP基因耐藥相關(guān)性突變的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人們的生命健康。全世界乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性者約3.5億，我國約有1.2億，其中3000萬為慢性乙型肝炎（chronichepatitisB,CHB）患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有80萬人死于HBV慢性感染所引發(fā)的重型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等相關(guān)疾病。因此防治HBV感染對(duì)提高人們的健康水平具有重要意義。
　　抗病毒治療是臨床上治療慢性乙型肝炎的主要

2、措施。核苷/酸類藥物因其用藥方便、副作用少、能迅速抑制HBV復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。臨床上應(yīng)用的此類藥物主要有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韋（ETV）等，但隨著用藥時(shí)間的延長，出現(xiàn)HBV耐藥相關(guān)性變異的機(jī)率越來越高，并隨之出現(xiàn)HBV-DNA反跳、肝功能惡化，因此耐藥已成為抗HBV治療中迫切需要解決的問題。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HBV在人體免疫壓力和藥物作用下易發(fā)生變異，加之HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（reverset

3、ranscriptase,RT）區(qū)不具備校正功能，更加劇了HBV的突變，使病毒持續(xù)存在和不斷復(fù)制，導(dǎo)致病情進(jìn)展。近年來，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量探索，盡管建立了多種檢測HBV耐藥相關(guān)性基因變異的方法，但各有其特點(diǎn)和局限性，因此建立一種具有較高特異性和靈敏性且操作簡便的方法對(duì)于國內(nèi)臨床抗HBV治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究旨在建立和優(yōu)化擴(kuò)增慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本中HBVP基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainrea

4、ction,PCR）方法，比較DNA序列測定與線性反向探針雜交法（INNO-LiPA試劑）檢測HBV基因突變的結(jié)果，以期為指導(dǎo)臨床制定合理的個(gè)體化治療方案提供重要手段。
　　93例研究對(duì)象均系慢性乙型肝炎患者，男77例，女16例，年齡16～66歲；HBsAg陽性均超過6個(gè)月；既往接受核苷/酸類藥物治療至少6個(gè)月。所有患者治療期間均出現(xiàn)可疑耐藥的情況，或者血清HBV-DNA不同程度下降后又出現(xiàn)反彈，或者HBVDNA自最低值上升＞1l

5、og10copies/mL，并伴或不伴有ALT升高。以上研究均獲得患者的知情同意。
　　研究的內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.HBV血生化指標(biāo)
　　抽取使用核苷/酸類藥物不同階段慢性乙型肝炎患者的外周血，常規(guī)檢測HBV-DNA、ALT和TBiL等血生化指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)患者的HBV-DNA和ALT與治療前相比均明顯降低（P＜0.05），但是LAM組和聯(lián)合用藥組的HBV-DNA在治療13～24月階段比7～12月階段明顯升

6、高(P＜0.05)。TBiL變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.擴(kuò)增HBV-DNAP基因逆轉(zhuǎn)錄酶片段巢式PCR方法的建立
　　根據(jù)GenBank收錄的HBVadr亞型基因全序列（GI:329616）。采用Oligo6.67軟件輔助分析，設(shè)計(jì)巢式PCR引物，通過反復(fù)試驗(yàn)，篩選出有較好序列兼容性及較高反應(yīng)效率的外引物和內(nèi)引物，目的片段大小為725bp，包括RT區(qū)A、B、C、D、E亞區(qū)。用不同病毒載量的患者血清提取出的HBV-DNA作為模

7、板，反復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化巢式PCR反應(yīng)條件，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　3.DNA序列測定
　　取PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定（由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司完成），成功測序86份，其中含2例血清標(biāo)本中的HBV-DNA＜1×103copies/mL者。進(jìn)一步用SeqmanTMⅡ、EditSeqTM和MegAlign軟件進(jìn)行分析,共檢測到突變位點(diǎn)113個(gè)。除已知確定的相關(guān)耐藥位點(diǎn)外，還檢測到V84I、S85C、A181S、

8、L229W、N238H、N238A和N238T等突變位點(diǎn)。
　　4.線性探針反向雜交法的檢測
　　隨機(jī)抽取40例患者的血清標(biāo)本，用線性反向探針雜交法（INNO-LiPAHBVDRv3）檢測已知的11個(gè)耐藥位點(diǎn)，即HBV-DNA聚合酶的第80、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250位氨基酸。經(jīng)擴(kuò)增、雜交、洗脫、顯色后在檢測條帶上呈紫/棕色沉淀物。在40份血清標(biāo)本中檢出了以下突變形式：10

9、例L180M+M204V,1例V173L+L180M+M204V，7例M204I,另有L80I+M204I、L80I、L80V、A181T、A181V和N236T各1例。僅5例與DNA測序結(jié)果不一致。
　　結(jié)論：
　　1.核苷/酸類藥物長期使用可導(dǎo)致耐藥，多出現(xiàn)在治療12個(gè)月以后。
　　2.建立在巢式PCR基礎(chǔ)上的DNA序列測定法，其敏感性與INNO-LiPA相當(dāng)，檢測結(jié)果與INNO-LiPA試劑有較高符合率，并可檢出