金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測方法的建立及應用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種人獸共患病病原體，屬于革蘭陽性球菌，廣泛存在于自然界，可以引起人和其他動物的各種疾病。目前檢測金黃色葡萄球菌方法有很多，但這些方法大都比較費時費力，且價格昂貴。
　　 目的:建立一種檢測金黃色葡萄球菌的簡單、快速、靈敏、準確的方法。使用該方法檢測實驗動物是否感染金黃色葡萄球菌，并且與傳統(tǒng)檢測方法進行比較，探討該方法的可行性。
　　 方法:1.根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因，設計一對通用引物及

2、兩條特異性探針，探針使用多聚物進行加尾。用生物素標記通用引物的5'端，使用該引物進行PCR擴增，獲得用于雜交的日的片段。
　　 2.將兩條特異性探針固定于硝酸纖維膜上，使PCR產物與探針雜交。設計優(yōu)化實驗，對探針的修飾及濃度、雜交條件、洗脫條件、抗體濃度等進行優(yōu)化，篩選得到最佳反應條件，用于金黃色葡萄球菌的檢測。
　　 3.使用建立的反向線性雜交方法方法對重慶地區(qū)74只實驗動物進行金黃色葡萄球菌的檢測，同時使用傳統(tǒng)方法對

3、這些樣本進行檢測，比較兩種方法的一致性。
　　 結果:1.選擇金黃色葡萄球菌的保守序列設計了引物及特異性探針，成功構建了nuc基因的重組質粒。2.優(yōu)化后的最佳雜交反應條件為:探針進行15C多聚加尾，探針濃度為50μmol/L，采用紫外交聯(lián)及高溫烘烤的方式固定探針。生物素-堿性磷酸酶抗體稀釋倍數(shù)為1∶5000。37℃雜交60min，并用洗脫液(0.5×SSC，0.1％ SDS)在50℃洗脫15 min，使用堿性磷酸酶催化NBT/B