共刺激分子CD80分子上調Graves病免疫應答的臨床和實驗研究.pdf

1、第一部分: 目的：探討可能影響甲亢患者服藥后再次復發(fā)的多種危險因素。 方法：選取96例初診Graves病患者，正規(guī)抗甲亢藥物治療(ATD)一年,然后繼續(xù)進行為期半年的隨訪觀察,評價治療效果。將分為治療緩解組和復發(fā)組。ELISA法測定血清TRAb濃度，熒光定量PCR測定外周血單個核細胞表面共刺激分子CD80 mRNA含量，溫和酸消化法測定血清總碘含量。以血清總碘含量、TRAb濃度、外周單核細胞(PBMC)膜上CD80mRN

2、A含量等可能影響甲亢治療預后的危險因素為自變量，以ATD一年半后緩解或復發(fā)為應變量，結合其他臨床參數(shù)進行病例對照研究，做多因素條件logistic回歸分析。直線相關分析TRAb和CD80 mRNA以及血清總碘含量的相關性。 結果：多因素logistic回歸模型確定系數(shù)R2=0.783（p=0.007），進入回歸模型的危險因素有：TRAb 濃度（βj＝0.565，OR＝5.506），家族史（βj＝0.528，OR＝3.401），C

3、D80mRNA 含量（βj＝0.453，OR＝3.089），血清總碘含量（βj＝0.389，OR＝1.497），發(fā)病年齡（βj＝0.272，OR＝1.301）。相關性分析顯示：血清TRAb 濃度(r=0.79)和CD80含量之間的相關性大于血清總碘(r=0.45)。 結論：CD80含量和血清TRAb濃度相關性高于血清總碘含量?；颊逿RAb 濃度增高、具有甲亢陽性家族史、PBMC表面CD80mRNA表達量增高、血清總碘含量增高、發(fā)

4、病年齡早可能是導致ATD復發(fā)的重要危險因素。 第二部分: 目的：構建表達mCD80基因真核質粒載體。大量擴增并提純pcDNA3.0-hTSHR質粒和pcDNA3.0-mCD80質粒。獲得瞬時表達hTHR的CHO細胞，為測定第二信使cAMP提供檢測載體。 方法:用RT-PCR方法獲得Balb/C鼠CD80基因全長序列,插入真核表達質粒pcDNA3.0。降重組表達質粒pcDNA3.0-mCD80,轉化大腸桿菌DH5α

5、篩選陽性克隆,雙酶切和基因測序鑒定。脂質體介導pcDNA3.0-hTSHR轉染CHO細胞并用Western blot免疫印記法檢測轉染產物的表達。 結果:重組質粒雙酶切后凝膠電泳產生兩條大小分別為5.4kb和2.7kb的片斷，大小和預期相同。基因公司測序結果與Genebank中的全長序列一致。在700ug/ml的G418濃度壓力下，獲得瞬時轉染CHO細胞,Western blot結果表明該蛋白具有明顯的免疫增強作用。 結

6、論:用基因工程技術獲得mCD80基因真核表達質粒,為進一步研究CD80分子的對甲亢免疫應答過程的影響奠定了基礎。 第三部分: 目的：探討基因槍注射和普通質粒肌肉注射兩種不同方法對甲亢動物模型的差異。 方法：對45只小鼠進行隨機分成四組，分別用基因槍金顆粒包裹質粒免疫、普通質粒肌肉注射免疫。加強免疫后第4周后處死小鼠RIA 法測定血清FT3、FT4、TSH水平。RIA法測定血清與hTSHR-CHO孵育后上清cAMP

7、濃度以計算TRAb 活性，RIA法測定脾臟培養(yǎng)后IL-4的濃度，ELISA法測定血清TSAb 濃度，取甲狀腺做石蠟HE切片觀察組織學變化。 結果：基因槍免疫組(GGI)動物4周后血清FT4（0.34±0.11）pg/ml高于質粒肌肉注射組(PLS)（0.21±0.06）pg/ml和基因槍免疫空質粒組(GG0)（0.17±0.08）pg/ml（F=14.34，p=0.002）。GGI組TRAb活性（167.27±37.37）％高于

8、PLS組（113.81±25.50）％和GG0組（98.27±14.80）％（Hc=35.198，p＝0.007）。GGI組脾臟培養(yǎng)上清液IL-4產量（0.244±0.092）pmol/L明顯高于PLS組（0.173±0.039）pmol/L和GG0組（0.151±0.041）pmol/L(F=7.0403，p＝0.005)。GGI組TRAb濃度（29.3±1.2）IU/L明顯高于GG0組（13.3±0.2）IU/L（F=9.02，p<

9、0.001），但和PLS組（24.3±0.9）IU/L比無顯著性差異（q＝-1.32，p＝0.423）。HE切片觀察造模成功小鼠甲狀腺濾泡細胞高柱狀排列，未出現(xiàn)甲狀腺細胞破壞甲狀腺炎的嗜酸性變。 結論：基因槍免疫雌性Balb/c鼠是一種可行的復制Graves動物模型，在免疫第2-4周可以觀察到FT4升高和自身抗體改變等理想的免疫效果。 第四部分: 目的:為了進一步明確共刺激分子CD80在甲狀腺疾病中的作用和明確G

10、raves’病甲亢自身免疫疾病的病理生理機制。 方法: 40只遠交系Balb/c小鼠隨機分成A，B，C，D 四組，分別為用表達pCDNA3.1-mCD80和pCDNA3.1-hTSHR的質粒用基因槍免疫。兩周后處死小鼠，留取血清測定游離甲狀腺素（FT4）水平以確定是否造模成功，ELISA法測定血清TRAb濃度，脾臟原代培養(yǎng)7天后放射免疫法測定培養(yǎng)上清液INF-γ和IL-4濃度，離心柱粗提血清IgG后和轉染人hTSHR－CHO細胞

11、共同孵育測定培養(yǎng)液釋放cAMP濃度。HE染色切片觀察甲狀腺形態(tài)學變化。 結果:同時注射兩種質粒的小鼠B組FT4水平高于其他三組(0.40±0.13)pg/ml(F=57.02，p<0.0001)，小鼠血清TRAb濃度(31.6±2.7)IU/L(F=11.90，p<0.0001)和TRAb活性(179.14±44.96)％也高于對照組。B組小鼠脾臟原代培養(yǎng)上清液IL-4的產量(0.226±0.029) pmol/L(F=13.2