CD147分子參與免疫突觸形成介導(dǎo)T細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究.pdf

1、HAb18G/CD147分子是本實(shí)驗(yàn)室前期利用肝癌特異性抗體HAb18，篩選人肝癌組織 cDNA表達(dá)文庫(kù)所獲得的一種新的肝癌相關(guān)抗原，是一種分子量約為35～65 kDa的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的HAb18G/CD147分子能夠參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控以及侵襲、轉(zhuǎn)移等多種過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞表面CD147分子表達(dá)量的高低直接影響著腫瘤的治療效果和預(yù)后。

2、近年來(lái)，越來(lái)越多的注意力集中在CD147分子與免疫相關(guān)性疾病的研究中，尤其是CD147分子與T細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞亞群異?；罨閷?dǎo)的免疫炎癥性疾病的研究。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)表達(dá)的CD147分子與T細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞活化相關(guān)免疫炎性疾病之間存在著顯著的關(guān)聯(lián)性。
　　免疫突觸是 T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞在相互結(jié)合的交界面所形成的一種超分子活化簇結(jié)構(gòu)，參與了T細(xì)胞的活化增殖過(guò)程。本科室前期研究表明，HAb18G/CD147分子在TCR/CD3

3、活化的T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可能與TCR輔受體CD4/CD8分子以及脂筏標(biāo)記分子CD48共定位于免疫突觸中，提示CD147分子可能與免疫突觸的形成有關(guān)。考慮到很多慢性炎癥性自身免疫病存在T細(xì)胞的異?；罨殡SCD147分子的顯著上調(diào)，那么，CD147是否能夠通過(guò)參與免疫突觸的形成介導(dǎo)T細(xì)胞的活化從而促進(jìn)相關(guān)自身免疫病的發(fā)生發(fā)展呢?
　　本研究針對(duì)上述科學(xué)問(wèn)題，旨在闡明HAb18G/CD147作為T(mén)細(xì)胞活化相關(guān)抗原在免疫突觸形成中的

4、作用及其參與T細(xì)胞活化的具體機(jī)制，并為后期開(kāi)發(fā)靶向CD147治療T細(xì)胞活化相關(guān)自身免疫病的藥物提供一定的理論依據(jù)。研究分為以下四部分：
　　第一部分CD147分子在T細(xì)胞中的分布和表達(dá)研究。CD147分子早已被證明與T淋巴細(xì)胞的活化相關(guān)。但是，其在不同T細(xì)胞亞群的分布以及對(duì)不同刺激條件的表達(dá)變化還不是很清楚。首先分析了不同亞群CD4+T細(xì)胞表面CD147分子的表達(dá)情況以及不同刺激活化條件下各 T淋巴細(xì)胞亞群膜表面 CD147分子的

5、表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未活化的CD4+T表面CD147分子雖有表達(dá)，但水平較低；在不同的誘導(dǎo)條件下，CD4+T細(xì)胞活化后CD147分子的表達(dá)均有明顯上調(diào)，以CD3和CD28雙抗體刺激條件下CD147上調(diào)最為明顯，且具有一定的時(shí)效性。CD147分子在記憶性T細(xì)胞膜表面的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于幼稚性T細(xì)胞，而且活化后記憶性T細(xì)胞膜表面CD147分子的表達(dá)也明顯高于幼稚性T細(xì)胞，提示CD147分子可能在記憶性T淋巴細(xì)胞的活化中發(fā)揮更加重要的作用。鑒于此

6、，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均選擇CD147表達(dá)相對(duì)較高的記憶性T細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行免疫突觸和T細(xì)胞活化相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分CD147分子在免疫突觸中的定位及作用研究。在確定CD147高表達(dá)于活化T細(xì)胞表面的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步觀(guān)察了CD147分子是否存在于活化的T細(xì)胞免疫突觸中，即參與免疫突觸的形成，以及其在免疫突觸中的具體定位。采用Jurkat T–Raji B細(xì)胞模型，模擬人體內(nèi)T–APC細(xì)胞之間免疫突觸的形成，激光共聚焦顯微鏡和免疫膠體

7、金電鏡結(jié)果均表明CD147分子存在于T–B細(xì)胞形成的免疫突觸中。通過(guò)對(duì)免疫突觸橫斷面結(jié)構(gòu)的三維立體重建，我們發(fā)現(xiàn)90％左右的CD147分子與外周超分子活化簇標(biāo)志分子CD2存在共定位，提示CD147分子主要分布于外周超分子活化簇區(qū)域。進(jìn)一步通過(guò)慢病毒載體技術(shù)分別干涉了Jurkat T和Raji B細(xì)胞表面CD147分子的表達(dá)，觀(guān)察其對(duì)免疫突觸形成的影響。發(fā)現(xiàn)下調(diào)T細(xì)胞膜變面的CD147分子后，T-B細(xì)胞之間未見(jiàn)明顯的免疫突觸形成。然而，下

8、調(diào)B細(xì)胞的CD147并不影響免疫突觸的形成。據(jù)此，得出結(jié)論： CD147分子在免疫突觸形成中確實(shí)發(fā)揮了重要的作用，而且主要是T細(xì)胞上的CD147分子發(fā)揮作用。
　　第三部分CD147分子介導(dǎo)人體內(nèi)T細(xì)胞免疫突觸形成及活化研究。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用人體內(nèi)T-APC取代了體外細(xì)胞系Jurkat T-Raji B作為免疫突觸模型，更為真實(shí)的反映了體內(nèi)CD147分子參與免疫突觸的情況。實(shí)驗(yàn)將體外分離的單核細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，

9、通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察其與記憶性 T細(xì)胞之間免疫突觸的形成情況，以確定CD147分子在人體內(nèi)T細(xì)胞免疫突觸形成中的定位，并進(jìn)一步研究了CD147分子對(duì)免疫突觸形成和T細(xì)胞活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的CD147分子在人體內(nèi)活化的T細(xì)胞中也募集于免疫突觸部位。應(yīng)用CD147特異性單抗HAb18不僅可以抑制T細(xì)胞表面早期活化指標(biāo)CD69分子的表達(dá)，而且也下調(diào)了T細(xì)胞表面晚期活化指標(biāo)CD25分子的表達(dá)；同時(shí)還顯著減少了IL-2的分泌水平。這

10、些結(jié)果均提示CD147分子在活化T細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　第四部分CD147分子參與免疫突觸和T細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究。CD147分子聚集于免疫突觸中并在T細(xì)胞的活化中起到一定的作用。可是由于CD147分子的胞內(nèi)段很短，目前對(duì)于其是否能夠參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)尚無(wú)確切的研究細(xì)節(jié)。根據(jù)文獻(xiàn)相關(guān)結(jié)果，考慮CD147分子可能與其它分子相互作用參與突觸形成及T細(xì)胞活化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，CD147分子下調(diào)后，并不影響膜表面 CD3、CD2

11、、LFA-1以及CD48分子的表達(dá)，但是CD98分子的表達(dá)卻明顯下調(diào)。而且通過(guò)三維立體結(jié)構(gòu)重建技術(shù)，在T-B細(xì)胞形成的突觸部位可以觀(guān)察到90%以上的CD147和CD98分子的共定位，提示CD147可能與CD98相互作用共同參與免疫突觸的形成及其后續(xù)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。為了進(jìn)一步闡明CD147作用的主要信號(hào)分子，又分別應(yīng)用了CBA和Luminex等高通量技術(shù)檢測(cè)了參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要分子，并通過(guò) Western予以驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CD

12、147單克隆抗體阻斷后，T細(xì)胞內(nèi)p-ZAP70、p-ERK、p-C-JUN、p-CREB以及p-LAT的水平明顯降低，提示CD147分子參與T細(xì)胞活化的功能可能與這些分子相關(guān)。CD147能夠從MAPK以及PI3K-AKT等多條信號(hào)通路參與T細(xì)胞的活化過(guò)程，這也為后期開(kāi)發(fā)HAb18作為一種靶向CD147治療T細(xì)胞活化相關(guān)自身免疫病的藥物提供了一定的理論依據(jù)。
　　綜上所述，CD147分子高表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，參與了T-APC細(xì)胞