CD80共刺激分子單獨表達誘導免疫耐受機理初探.pdf

1、研究背景：特異性抑制排斥反應，誘導免疫耐受是器官移植面臨的主要挑戰(zhàn)之一。T細胞作為免疫反應的主要細胞，無論對免疫排斥還是免疫耐受都起到關鍵作用。T細胞活化需要MHC復合體提供第一信號及共刺激分子提供第二信號。CD80/CD86是重要的共刺激分子，通過與受體CD28/CTLA-4結合，調控T細胞活化及分化。CD80/CD86作為同源分子，一直被認為功能相似。但最近研究發(fā)現(xiàn)，二者功能不盡相同。對CD80/CD86與CD28/CTIA-4系統(tǒng)

2、的生物物理學研究表明，CD80能與CTLA-4形成更穩(wěn)定的結合，有體內外實驗證實CD80能抑制T細胞增殖，而CD86不能，提示CD80很可能主要通過CTLA-4傳遞抑制信號，抑制免疫反應。 皮膚作為免疫原性最強的器官，常規(guī)異基因移植很難避免排斥反應。但有研究顯示，培養(yǎng)的小鼠皮膚角朊細胞同種異體移植后急性排斥反應不明顯，角朊細胞能被CD8<'+>T細胞識別，但不被排斥。另有研究發(fā)現(xiàn)少量自體角朊細胞與同種異體甚至異種角朊細胞混合培養(yǎng)

3、后移植，不發(fā)生明顯的急性排斥，慢性排斥也不明顯，移植皮片能長期存活。 本研究受國家973計劃(2003CB15504)、國家自然科學基金(30371355)和教育部博士點基金(SRFDP 2002061 0088)資助理不明。我們前期實驗從基因和蛋白兩個層面證實培養(yǎng)的小鼠角朊細胞能單獨表達CD80蛋白，不表達CD86蛋白。實驗中還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的小鼠心肌細胞也能單獨表達CD80蛋白。本研究進一步探討培養(yǎng)的近交系小鼠角朊細胞膜片誘導免疫

4、低反應現(xiàn)象與角朊細胞單獨表達CD80共刺激分子的關系，并對同樣單獨表達CD80分子的小鼠心肌細胞也進行了免疫學相關檢測，用兩個不同細胞模型來驗證CD80單獨表達誘導免疫耐受的可能性。 研究方法：分別培養(yǎng)乳鼠角朊細胞及心肌細胞，通過免疫熒光、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain：reaction)檢測培養(yǎng)細胞CD80/CD86表達情況。將培養(yǎng)的角朊細胞和心肌細胞分別與預活化同種

5、異體細胞毒性淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)共培養(yǎng)，檢測殺傷率，另用不表達CD80分子或表達CD80但加入anti-CD80抗體的相同細胞作對照。為檢測自體角朊細胞在免疫耐受中有何作用，以培養(yǎng)的角朊細胞為調節(jié)細胞，以不同比例加入同基因和同種異基因脾細胞混合培養(yǎng)體系中，用MTT法測淋巴細胞增殖率。同樣用不表達CD80分子或表達CD80但加入anti-CD80抗體的相同細胞作對照。為檢測CD80是否通過

6、CTLA-4途徑影響免疫反應，在上述表達CD80的細胞反應體系中，均加入anti-CTIA-4抗體，封閉CTLA-4通路。 結果：乳鼠角朊細胞培養(yǎng)1天后檢測，抗CD80抗體未顯色。培養(yǎng)7天后，抗CD80抗體顯色明顯加強，形態(tài)規(guī)則，胞核明顯。相同條件下檢測CD86表達，在培養(yǎng)1、7天時均未發(fā)現(xiàn)抗CD86抗體著色。乳鼠心肌細胞培養(yǎng)10天后增殖心肌細胞高表達CD80蛋白，而CD86蛋白檢測不到。RT-PCR顯示培養(yǎng)10天心肌細胞CD8

7、0 mRNA表達強度與β-actin相似，但CD86 mRNA表達很低。 CTL殺傷實驗中，培養(yǎng)7天同種異體角朊細胞殺傷率在各個E：T比時均低于培養(yǎng)1天角朊細胞。用anti-CD80抗體封閉CD80與anti-CTIA-4抗體封閉CTLA-4后，CTL殺傷率均上升，7天和1天培養(yǎng)的角朊細胞殺傷率相近。培養(yǎng)10天的同種異體心肌細胞在E：T從3：1到30：1時，殺傷率為6.36％到39.66％，加入anti-CD80和anti-CT

8、IA-4抗體后，殺傷率幾乎增加了1倍。 單向混合淋巴細胞增殖實驗結果顯示，培養(yǎng)7天自體角朊細胞能抑制單向混合淋巴細胞增殖反應(mixed lymphacyte：reaction，MLR)，并隨自體角朊細胞的增加，抑制增強，在E：T：auto-KC=1：1：1.5時到達最大效應。同種異體角朊細胞則不能抑制MLR，相反有促進作用。培養(yǎng)1天的角朊細胞也不能抑制MLR，其MLR增殖程度與未加角朊細胞MLR增殖程度相似略有增加。用抗體封閉

9、培養(yǎng)7天角朊細胞CD80后，抑制作用消失，但仍低于培養(yǎng)1天角朊細胞。anti-CTIA-4阻斷CD80與CTLA-4結合，培養(yǎng)7天自體角朊細胞抑制作用也消失，甚至隨自體角朊細胞數(shù)量增加，有促進MLR的趨勢。 結論：本實驗結果提示，角朊細胞和心肌細胞等實體細胞在一定條件下能單獨表達CD80，與自身MHC分子配合，可成為一種有效的調節(jié)性抗原提呈細胞(regulatory antigen present cell，rAPC)，對免疫反