微流控芯片和氧化石墨烯在乙型肝炎檢測(cè)與預(yù)防中的應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的感染不僅可引起急、慢性病毒性肝炎(Acute and chronic hepatitis)，而且還與肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，目前我國(guó)HBV感染者約有9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)人。乙型肝炎病毒可分為A到J共10個(gè)基

2、因型，我國(guó)以B、C基因型占優(yōu)勢(shì)?；蛐筒町惒粌H影響e抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換、前C區(qū)啟動(dòng)子和前C區(qū)的突變位點(diǎn)、疾病的發(fā)展進(jìn)程，還與抗病毒療效有關(guān)?；蚍中驮\斷有助于臨床醫(yī)生針對(duì)患者制定個(gè)體化的治療方案。
　　為了克服目前HBV基因分型法存在的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、特異性差等缺點(diǎn)，我們將微流控芯片、巨磁阻傳感器、磁性納米團(tuán)簇、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop mediatedisothermal amplification，LAMP)以及線(xiàn)性探針雜

3、交技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速區(qū)分中國(guó)HBV優(yōu)勢(shì)基因型B和C的微流控芯片檢測(cè)方法，它集樣品混合、核酸擴(kuò)增和信號(hào)采集等多功能于一體，具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、特異性以及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
　　本論文首先建立了一種集成巨磁阻傳感器、微流控芯片、磁性納米團(tuán)簇、PCR擴(kuò)增和核酸雜交于一體的乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)方法。172 nm左右的磁性納米團(tuán)簇表面修飾有鏈霉親和素，可與“PCR產(chǎn)物——核酸探針”雜交復(fù)合物末端的生物素發(fā)生特異性結(jié)合，G

4、MR傳感器可對(duì)停留其表面的磁性納米團(tuán)簇進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度初步達(dá)到200 IU·mL-1(103 copies·mL-1)。隨后，又對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化升級(jí):我們將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)集成在微流控芯片中，進(jìn)行核酸樣品的高效擴(kuò)增。同時(shí)，GMR傳感器不再集成在微流控芯片中，而是作為獨(dú)立檢測(cè)器以供重復(fù)使用。最終可在一小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)最低10 copies·mL-1 HBV DNA的基因分型檢測(cè)。此后，為了在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增前核酸樣本與反應(yīng)試

5、劑的快速高效混合，我們基于仿生學(xué)的原理，設(shè)計(jì)了一種由高深寬比的直通道單元與高寬深比的圓形室單元重復(fù)交替相連而成的微混合器。
　　此外，為了評(píng)估氧化石墨烯作為HBV疫苗免疫佐劑的可能性，我們通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別研究了氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）和經(jīng)過(guò)PVP修飾的氧化石墨烯(PVP-GO)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等主要免疫細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，氧化石墨烯經(jīng)PVP修飾后，其免疫學(xué)毒性明顯降低，并具有一定的免